于小芳

(鄭州市中醫(yī)院 制劑室，河南 鄭州 450000)

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物，最早見于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國最早記載被用作治病的蘭科植物之一。鐵皮石斛藥用歷史悠久，至今已經(jīng)歷了兩千多年的用藥驗證，中醫(yī)認為鐵皮石斛性微寒﹑味甘，歸胃﹑腎經(jīng)，具有益胃生津，滋陰清熱的功效；現(xiàn)代藥理學(xué)證實其具有促進胃腸蠕動﹑增強免疫功能﹑抗腫瘤﹑抗衰老﹑降血糖﹑抗誘變﹑抑菌等作用。鐵皮石斛屬于蘭科植物，喜歡在涼爽﹑潮濕的環(huán)境中生長，且其不耐寒，對溫度的要求很高，適宜生長溫度在15～28℃左右；我國多分布在安徽﹑浙江﹑云南﹑廣東等地區(qū)。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛的化學(xué)成分主要是石斛多糖，具有較高的藥用價值。已有研究顯示，不同產(chǎn)地﹑不同年限的鐵皮石斛多糖組成有所差異，其藥效作用也有所差異。高效液相色譜(HPLC)是目前藥物成分分析﹑藥物質(zhì)量控制的重要手段。既往研究采用HPLC分析了不同產(chǎn)地鐵皮石斛的質(zhì)量，但對不同產(chǎn)地和年限的相關(guān)研究鮮有報道。因此，本研究分析了云南不同產(chǎn)地﹑不同年限鐵皮石斛的HPLC分析，旨在為鐵皮石斛的臨床應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑

D-鹽酸氨基葡萄糖對照品，D-甘露糖對照品，D-葡萄糖對照品，均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙酸銨﹑苯酚﹑1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-pheny-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)﹑三氟乙酸溶液﹑氫氧化鈉﹑鹽酸溶液﹑乙腈(色譜純)﹑甲醇﹑無水乙醇﹑三氯甲烷。

1.1.2 儀器設(shè)備

SHIMADZU分析天平，感量0.1 mg；電子天平，感量0.1g；純化水系統(tǒng)；微量移液器；Agilent 1200高效液相色譜儀；色譜柱，Agilent C18；超聲儀等。

1.1.3 試驗藥物

云南文山種(1～3年生)﹑云南西雙版納種(1～3年生)﹑云南保山種(1～3年生)鐵皮石斛分別購自云南文山﹑西雙版納﹑保山地區(qū)藥材公司。

1.1.4 藥物及試劑的制備

對照品溶液的制備：使用電子天平精密稱取60 mg D-鹽酸氨基葡萄糖對照品粉末，加適量純凈水溶解后，倒入5 mL容量瓶中，然后加入純凈水稀釋至刻度，制成12 mg/mL的內(nèi)標溶液；另同樣方法稱取10 mg甘露糖和10 mg葡萄糖對照品，加適量純凈水溶解后，倒入100 mL容量瓶中，并加入1 mL內(nèi)標溶液(在1 mL量筒中加入內(nèi)標溶液至刻度)，然后加入純凈水稀釋至容量瓶刻度線，搖勻后備用。

鐵皮石斛多糖的提?。焊稍镨F皮石斛藥材分別研磨粉碎，過三號篩(50目)后，使用電子天平精密稱取0.12 g粉末倒入100 mL干燥潔凈圓底燒瓶中，加入適量80%乙醇溶液，加熱回流提取4 h，棄去濾液，濾渣烘干乙醇后置入100 mL燒杯中，重復(fù)提取兩次，合并濾渣，并加入2 mL內(nèi)標溶液(在2 mL量筒中加入內(nèi)標溶液至刻度)，加水100 mL攪拌均勻，電熱套或沸水浴煮1 h，過程中不停地進行攪拌，放冷，加水至100 mL，混勻，離心，備用。

鐵皮石斛多糖的水解：吸取1 mL鐵皮石斛多糖溶液， 置入安瓿瓶中，加入2.0 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL，酒精噴燈封口后，120℃烘箱中水解4 h，除去不溶物(濾膜過濾)和三氟乙酸(減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，純凈水洗滌，重復(fù)過濾﹑蒸發(fā)3次后，加入2 mL蒸餾水溶解后，倒入玻璃試管(帶磨口塞)中，減壓干燥箱干燥過夜(溫度設(shè)定為70℃)，保存，備用。

衍生化產(chǎn)物的制備：吸取400 μL甘露糖和葡萄糖對照品溶液以及供試品溶液于試管中，加0.5 mol/L的 PMP甲醇溶液與0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70℃水浴反應(yīng)100 min。再加0.3 mol/L的鹽酸溶液500 μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次 2 mL， 除去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液，保存。

流動相的配制：以乙腈-0.02mol/L的乙酸銨溶液(20∶80)為流動相。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC

樣品的制備：取鐵皮石斛多糖衍生化產(chǎn)物的制備液逐步稀釋為0.5μg/mL ，稀釋液為初始流動相，空白對照為初始流動相。取10μL樣品上樣檢測。

1.2.2 定量計算方法

以D-鹽酸氨基葡萄糖為內(nèi)標，利用校正因子來計算。

注：As為內(nèi)標峰面積，Ar為甘露糖標準品峰面積，Cs為內(nèi)標濃度，Cr為甘露糖標準品濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 鐵皮石斛多糖HPLC分析方法的建立

鐵皮石斛HPLC色譜條件的設(shè)置：色譜柱:Agilent C色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL，流動相比例為20∶80。HPLC分析方法檢測顯示，鐵皮石斛葡萄糖﹑甘露糖的出峰時間分別為26.89 min﹑58.0 3min，出峰附近沒有雜峰干擾，峰型尖銳，分離度好，可以滿足分析要求，見圖1。

圖1 對照品的HPLC檢測色譜圖

2.2 不同產(chǎn)地、不同年限鐵皮石斛多糖中單糖的HPLC檢測色譜圖

將不同產(chǎn)地﹑不同年限的9批鐵皮石斛多糖樣品依次進行HPLC檢測，記錄75 min色譜圖。見圖2。

圖2 樣品HPLC檢測色譜圖

2.3 不同產(chǎn)地、不同年限鐵皮石斛多糖中單糖的HPLC檢測色譜圖分析

云南文山﹑西雙版納﹑保山三個產(chǎn)地的鐵皮石斛多糖中甘露糖含量有一定差異，其中云南文山種鐵皮石斛多糖中甘露糖含量最高，甘露糖/葡萄糖的比值也高于西雙版納﹑保山產(chǎn)地，而西雙版納種鐵皮石斛多糖中甘露糖含量﹑甘露糖/葡萄糖的比值高于保山，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)；1年生﹑2年生﹑3年生的鐵皮石斛多糖中甘露糖含量同樣有一定差異，年限越高的鐵皮石斛中甘露糖的含量越高，甘露糖/葡萄糖的比值也越高，以上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。見表1。

表1 不同產(chǎn)地、不同年限鐵皮石斛多糖中樣品甘露糖含量和甘露糖與葡萄糖峰面積測定結(jié)果

3 討 論

HPLC是色譜法的一種，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑﹑緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。通過分析比較各樣品的HPLC色譜圖，可反映樣品中的化學(xué)成分，臨床常用于食品﹑藥品的成分分析和質(zhì)量評價。鐵皮石斛是一種常見的中藥材，鐵皮石斛多糖是其主要化學(xué)成分，具有抗氧化﹑抑菌﹑調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用。鐵皮石斛分布于我國多種產(chǎn)地，且不同年限的中藥材可能有不同的藥用價值，但目前對于不同產(chǎn)地和年限鐵皮石斛的系統(tǒng)分析少有報道。因此，本研究建立了不同產(chǎn)地和年限鐵皮石斛的HPLC圖譜，以期為臨床藥用研究提供數(shù)據(jù)支持。本研究中采用HPLC法建立了云南不同產(chǎn)地和年限鐵皮石斛多糖的色譜圖，以鐵皮石斛多糖的主要單糖組成鐵皮石斛甘露糖為對照品。本研究參照《中國藥典》中鐵皮石斛多糖中甘露糖的檢測方法，加入PMP進行鐵皮石斛多糖中的單糖衍生處理，HPLC色譜條件為嚴格參照藥典進行，流動相為乙腈-0.02mol/L的乙酸銨溶液，檢測波長為250 nm。結(jié)果顯示，鐵皮石斛葡萄糖﹑甘露糖的出峰時間分別為26.89 min﹑58.03 min，出峰附近沒有雜峰干擾，峰型尖銳，分離度好，可以滿足分析要求。

本研究將云南文山﹑西雙版納﹑保山三個產(chǎn)地﹑1年生﹑2年生﹑3年生三個年限鐵皮石斛多糖樣品依次進行HPLC檢測，記錄75 min色譜圖。云南文山﹑西雙版納﹑保山三個產(chǎn)地的鐵皮石斛多糖中甘露糖含量有一定差異，其中云南文山種鐵皮石斛多糖中甘露糖含量最高，甘露糖/葡萄糖的比值也高于西雙版納﹑保山產(chǎn)地，而西雙版納種鐵皮石斛多糖中甘露糖含量﹑甘露糖/葡萄糖的比值高于保山；1年生﹑2年生﹑3年生的鐵皮石斛多糖中甘露糖含量同樣有一定差異，年限越高的鐵皮石斛中甘露糖的含量越高，甘露糖/葡萄糖的比值也越高。年限較高的鐵皮石斛具有的藥物活性成分越高，有很高的經(jīng)濟和藥用價值。近年來，鐵皮石斛種植在我國南方地區(qū)迅速發(fā)展，并成為南方特色生物產(chǎn)業(yè)；云南鐵皮石斛是我國最珍貴的中藥材之一，云南野生鐵皮石斛已被列為瀕危植物，2008年云南石斛的種植面積已成為全國第一大省。已有研究顯示，云南種鐵皮石斛中多糖含量豐富，鐵皮石斛多糖是目前常用于評估鐵皮石斛質(zhì)量的有效成分。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖中單糖組成主要為甘露糖和葡萄糖，與高云霄等的研究基本一致，葡萄糖具有保護肝臟﹑補充熱能和體液﹑改善低血糖﹑改善脫水等作用；甘露糖具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)﹑增加傷口愈合﹑抑制炎癥﹑抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移﹑抑制細菌感染等作用，提示鐵皮石斛多糖中單糖組成比例可能會影響藥物活性，后期需進一步采用動物試驗或體外細胞試驗進行深入分析。本研究中云南文山種高年限鐵皮石斛中鐵皮石斛甘露糖含量較高，可用于臨床藥用。

綜上所述，不同產(chǎn)地﹑不同年限鐵皮石斛中鐵皮石斛多糖中的單糖組成有所差異，臨床可根據(jù)鐵皮石斛的HPLC色譜圖進行鑒別和質(zhì)量評估。