王志華 陳雪平 任姝靜 陸震 劉衛(wèi) 王玉玲

關鍵詞：糙米發(fā)酵濾液、斑馬魚、保濕、美白、舒緩、修復

隨著消費者對護膚品綠色、安全觀念的增強，以及對功效需求的持續(xù)增長，現(xiàn)代護膚品原料已由早期的化學合成物質向天然物質發(fā)展，原料生產技術也已經從化學合成、植物提取發(fā)展到生物發(fā)酵、生物合成，其中生物發(fā)酵技術是現(xiàn)階段行業(yè)的主流與熱點發(fā)展方向。相較于從植物中提取的原料和化學合成原料，發(fā)酵原料具有天然的屬性，可以將一些有致敏風險的大分子物質分解為小分子物質[1]，在發(fā)酵過程中還可以產生新的營養(yǎng)素，不僅營養(yǎng)豐富，生物活性和安全性也更高，且具備獨特的功效[2]。其基本原理是利用微生物緩慢發(fā)酵植物原料，釋放植物中的活性物質，再經微生物酶類修飾結構、改造或分解，進一步獲得有利于皮膚吸收，提高護膚功效的有價值的生物活性物質[3]。糙米作為最常見的全谷物原料，由于保留了種皮和胚芽，較高程度地實現(xiàn)了稻米的全營養(yǎng)保留，其中含有的酚類[4]、多糖[5]、蛋白質等成分具有提高人體免疫力、清除體內自由基、延緩衰老等美容功效，在護膚品領域有著廣泛的應用。因此，以糙米作為原料，提取其中有益于皮膚健康的活性物質，制成發(fā)酵濾液后，其主要成分為多種氨基酸、有機酸、小分子多肽等活性物質，在護膚領域具有極高的潛在應用價值。

所以，選擇合適的方法評價糙米發(fā)酵濾液在護膚品中的實際應用效果是十分必要的。

斑馬魚與人類具有高達87%的疾病相關基因相似度[6]，在醫(yī)藥領域應用已超過30年，相比于體外細胞實驗而言，斑馬魚是完整生物體實驗，測試結果更可靠。另外，斑馬魚個體小，繁殖力強，個體間差異小，可同時開展大量樣品實驗，且測試成本更低。因此，斑馬魚測試不論是在產品早期的原料篩選，還是配方驗證方面都得到了廣泛應用[7][8][9]。本文通過斑馬魚胚胎測試，研究了華熙生物科技股份有限公司的BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液（INCI名：酵母菌/大米發(fā)酵產物濾液）在皮膚保濕、美白、舒緩及修復方面的功能。

01材料與方法

1.1試劑

糙米發(fā)酵濾液、氯化鈉、苯硫脲工作液、硫酸銅、吲哚美辛工作液、蘇丹黑染色液、熟地黃提取物。

1.2儀器

SMZ645解剖顯微鏡（Nikon公司）、AZ100電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（Nikon公司）、96孔板（NestBiotech公司）、CP214精密電子天平（Ohaus公司）

1.3試驗動物

野生型AB系斑馬魚，以自然或成對交配方式進行繁殖。

02試驗部分

2.1補水保濕功效評價模型

斑馬魚表皮具有一定的滲透壓耐受范圍，超過耐受范圍將產生失水現(xiàn)象[10]。使用高滲透壓溶液處理斑馬魚，會導致斑馬魚尾部因失水而皺縮、變小。據此，可以建立斑馬魚補水保濕的誘導模型。

將72尾3d大斑馬魚胚胎隨機平均分成3組，各組轉移至3cm培養(yǎng)皿中，分別設置為空白對照組、模型對照組和樣品處理組，分別加入5mL魚胚胎培養(yǎng)液、5mL濃度為15g/L的氯化鈉溶液和5mL氯化鈉溶液（15g/L）與樣品（5g/L）的混合液，于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)3h后對魚胚胎進行顯微鏡拍照后用ImageJ測量尾部面積并進行計算和統(tǒng)計分析。

2.2美白功效評價模型

人類皮膚變黑的主要原因是酪氨酸酶促進黑色素合成，而斑馬魚具有和人類相同的黑色素調控機制，皮膚結構也與人類高度相似，且斑馬魚在胚胎階段是透明的，色素細胞易于觀察[11]，方便于顯微鏡下拍照，用分析軟件定量讀取黑色素含量水平，可比較魚胚胎黑色素變化水平，因此，斑馬魚技術可有效地評價護膚品的美白功效。

實驗參照T/SHRH036-2021化妝品黑色素抑制—斑馬魚胚胎測試方法。將96尾8h大斑馬魚胚胎分別置于96孔板中，每孔含1尾魚胚胎，隨機平均分為4組，設置為空白對照組、100%黑色素抑制組、陽性對照組和樣品處理組，分別加入0.2mL魚胚胎培養(yǎng)液、0.2mL濃度為1.5mg/mL的苯硫脲溶液（完全抑制黑色素生成，用作100%美白效果對標數據）、0.2mL濃度為2.5g/L的曲酸溶液和0.2mL濃度為5g/L的樣品溶液，于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)48h后對魚胚胎進行顯微鏡拍照，用ImageJ測量魚胚胎透光率作為色素信號強度并進行計算統(tǒng)計分析。

2.3舒緩功效評價模型（中性粒細胞）

斑馬魚胚胎的中性粒細胞和人體中性粒細胞在形態(tài)、生化和生理功能上高度相似。受到外界刺激后，免疫反應的發(fā)生將導致中性粒細胞致免疫細胞的遷移和聚集，而中性粒細胞是在損傷或病菌入侵部位第一批出現(xiàn)的白細胞，作用是清除感染或有害物質[12][13]，因此，應用硫酸銅誘導斑馬魚胚胎側線區(qū)域神經丘細胞損傷而引起中性粒細胞聚集的模型[14]進行測試，比較受試物處理組和模型對照組的魚胚胎側線區(qū)域中性粒細胞的數量變化，可作為評價原料、配方或產品舒緩功效的一種有效手段。

將72尾魚胚胎分為3組，各置于3cm培養(yǎng)皿中，設置為模型對照組、陽性對照組和樣品組，分別加入5mL含0.16mg/L五水硫酸銅的魚胚胎培養(yǎng)液、5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和0.0036mg/L吲哚美辛（已知具有抑制中性粒細胞聚集作用）[14]的魚胚胎培養(yǎng)液和5mL含0.16mg/L五水硫酸銅和5g/L樣品的魚胚胎培養(yǎng)液，于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)40—45min后，將魚胚胎進行固定并使用蘇丹黑染液（中性粒細胞特異性染料[15]）進行染色，顯微鏡下拍照后計數側線區(qū)域內中性粒細胞數目并進行計算和統(tǒng)計分析。

2.4修復功效評價模型

當皮膚受到傷害時必須快速重生來修復皮膚屏障，在胚胎階段，傷口愈合十分迅速且不會留下傷疤;但過了胚胎階段，傷口愈合需經過凝血、炎癥、皮膚再生、血管重生和肉芽組織的形成，最終形成傷疤等步驟。斑馬魚在傷口修復過程中，除了不會形成凝血外，其余皮膚修復過程與人類相同[16]。因此，可以作為人體皮膚修復功效的檢測篩查模型[17]。

將72尾切除尾鰭的魚胚胎隨機平均分為3組，轉移至96孔板中，每孔含1枚魚胚胎，分別設置為空白對照組、陽性對照組和樣品組，分別加入0.2mL魚胚胎培養(yǎng)液、0.2mL濃度為1mg/mL熟地黃提取物和0.2mL濃度為5g/L的樣品溶液，放置于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，然后于顯微鏡下對魚胚胎進行拍照，用ImageJ測量尾鰭長度并進行計算和統(tǒng)計分析。

2.5數據處理

以上功效評價結果均采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，數據采用獨立樣本T檢驗，P<0.05為具有顯著性差異。

03結果與討論

3.1補水保濕功效

如圖1所示，與空白對照組相比，模型對照組斑馬魚尾部面積明顯減小，表明斑馬魚補水保濕功效評價模型造模成功。樣品處理組斑馬魚胚胎尾巴面積明顯大于模型組，其收縮抑制率為72±4%（P=0.043），這說明BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液可以防止因高滲透壓引起的失水，具有顯著的補水保濕效果。

3.2美白功效

如圖2所示，空白對照組的斑馬魚胚胎具有較高水平的黑色素，與空白對照組相比，使用濃度為5g/L的糙米發(fā)酵濾液處理的斑馬魚胚胎，其黑色素含量明顯降低，抑制率達15±2.4%（P=0.00053），這說明BioyouthTMBrice糙米發(fā)酵濾液在該測試濃度下可以顯著抑制斑馬魚胚胎黑色素生成，具有一定的美白功效。

3.3舒緩功效

如圖3所示，經硫酸銅溶液處理后，模型組的斑馬魚胚胎側線區(qū)域具有較多的中性粒細胞聚集，而添加5g/L的糙米發(fā)酵濾液的試驗組，側線區(qū)域中性粒細胞數目明顯減少，抑制率為48±8%（P=0.00035），這說明BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液在該測試濃度下可以顯著抑制斑馬魚胚胎中性粒細胞聚集，具有顯著的舒緩功效。

3.4修復功效

如圖4所示，與空白對照組相比，樣品處理組斑馬魚尾鰭長度（紅色虛線與實線間距離）明顯增大，BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液在該測試濃度下對斑馬魚胚胎尾鰭修復促進率為17±2.4%（P=0.0023），該樣品具有一定的皮膚修復功效。

04結果與討論

綜上所述，濃度為5g/L的BioyouthTM-Brice糙米發(fā)酵濾液具有顯著的保濕、美白、舒緩和修復功效。推測其機理是：經過發(fā)酵后，其本身含有的酚類、多糖和大分子蛋白質類可以分解為小分子的氨基酸以及有機酸類等營養(yǎng)物質[18]，是天然保濕因子的主要成分，能夠促使糙米發(fā)酵濾液具有極強的水合、保濕能力，并且可以重塑皮膚屏障;另一方面，糙米中含有豐富的維生素E、植酸、乳酸、多酚類等多種活性成分[19]，能夠激活衰老細胞，促進表皮細胞分裂和基底層細胞再生，有助于促進皮膚屏障修復，減少炎癥反應的發(fā)生，此外，陳保平等人的研究證明，酵母菌/大米發(fā)酵濾液可以在一定程度上抑制黑色素生成，從而延緩皺紋、黃褐斑、老年斑的出現(xiàn)，使肌膚看起來光滑、明亮[20]。

因此，糙米發(fā)酵濾液作為化妝品原料，具有良好的護膚功效，作為護膚品配方基質，在保濕、美白、修復、舒緩等功效方面具有潛在的應用價值。