張華 姜慶 李杰 吳迪 張新

摘 要：目的：參加實(shí)驗(yàn)室盲樣考核活動(dòng)，提高實(shí)驗(yàn)室的銅綠假單胞菌定量檢驗(yàn)檢測(cè)能力。方法：按照盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）操作，以VITEK2生化鑒定儀輔助鑒定。結(jié)果：TL048考核樣品中銅綠假單胞菌的計(jì)數(shù)結(jié)果為2.6×102 CFU/250 mL。結(jié)論：盲樣考核獲得了滿意結(jié)果。通過盲樣考核可以提高實(shí)驗(yàn)室在日常檢驗(yàn)中對(duì)銅綠假單胞菌的辨識(shí)能力和檢測(cè)水平。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌;定量檢測(cè);盲樣考核

Results and Analysis of Blind Sample Examination for Quantitative Detection of Pseudomonas aeruginosa in?Drinking Water

ZHANG Hua， JIANG Qing， LI Jie， WU Di， ZHANG Xin

（Linyi Inspection and Detection Center， Linyi 276000， China）

Abstract： Objective： To participate in the laboratory blind sample assessment activities to improve the laboratorys quantitative detection ability of Pseudomonas aeruginosa. Method： According to the blind sample assessment work instructions and GB 8538—2016， the VITEK 2 biochemical identification instrument was used to assist in identification. Result： The count result of Pseudomonas aeruginosa in the test sample numbered TL048 was 2.6×102 CFU/250 mL. Conclusion： Satisfactory results were obtained in the blind sample assessment. The blind sample assessment can improve the laboratorys ability to identify and detect Pseudomonas aeruginosa in daily inspections.

Keywords： Pseudomonas aeruginosa; quantitative detection; blind sample assessment

銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬，為需氧、無芽孢、有運(yùn)動(dòng)能力以及乳糖非發(fā)酵革蘭染色陰性桿菌，是一種常見的條件致病菌，常見于各種感染性疾病，如尿路感染、呼吸系統(tǒng)感染、軟組織感染和各種全身感染，尤其是在燒傷患者和免疫缺陷患者中[1-2]。銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛，能夠適應(yīng)不同環(huán)境，且代謝多樣，涵蓋范圍廣泛，包括土壤、水（熱水浴缸、水槽、水龍頭、呼吸機(jī)和消毒水）、植物及動(dòng)物、空氣及其他富含水的場(chǎng)所（游泳池）[3-5]。

飲用水微生物污染是一個(gè)常見問題，對(duì)公眾健康有著嚴(yán)重的影響。銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，常在飲用水中檢測(cè)到。此外，人們?cè)絹碓街匾曂把b飲用水和礦泉水的銅綠假單胞菌污染情況。近些年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)桶裝水或瓶裝水中檢測(cè)出銅綠假單胞菌的情況報(bào)道日益增多，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌不合格率大于10%[6-7]。

我國(guó)最新飲用水標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲水》（GB 19298—2014）中微生物限量規(guī)定，按照二級(jí)采樣方案，同一批次的5份水樣品要求每份水樣品里不得檢出銅綠假單胞菌。如果檢出，則判定為不合格[8]。因此，銅綠假單胞菌檢測(cè)在食品安全檢驗(yàn)中具有重要意義。盲樣考核是為了保證各級(jí)食品安全承檢機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，提高檢驗(yàn)檢測(cè)水平，并以監(jiān)督和考核為目的的測(cè)評(píng)活動(dòng)。臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心參加了2022年由山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局組織的盲樣考核活動(dòng)，檢驗(yàn)項(xiàng)目為“飲用水中銅綠假單胞菌定量檢驗(yàn)”，結(jié)果為滿意。為提高實(shí)驗(yàn)室工作質(zhì)量，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

收到編號(hào)為TL048的銅綠假單胞菌質(zhì)控樣凍干粉1瓶，在棕色西林瓶?jī)?nèi)有白色粉末狀樣品，避光儲(chǔ)存于-20 ℃;樣品中的菌含量為0～1.0×106 CFU/250 mL;實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株：陽(yáng)性對(duì)照菌株為銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC21636），陰性對(duì)照菌株為熒光假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC21620），從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心采購(gòu)。

1.2 培養(yǎng)基

假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CN平板）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、乙酰胺肉湯和綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基都在保質(zhì)期內(nèi)，從北京陸橋股份有限公司采購(gòu);VITEK2 GN卡，法國(guó)生物梅里埃公司。

1.3 儀器設(shè)備

VITEK2 compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，法國(guó)生物梅里埃公司;AC2-4S1生物安全柜，新加坡ESCO;ZGP-2270隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海智誠(chéng)公司;ZF-2型三用紫外儀，上海安亭電子儀器廠;MLS3780高壓蒸汽滅菌器，日本三洋公司;HTY-2000B集菌儀，杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司;0.45 ?m薄膜過濾器，北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司;微量移液槍，Gilson公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品溶解

按照作業(yè)指導(dǎo)書，取出盲樣考核樣品并在室溫下放置5 min，在生物安全柜內(nèi)將銅綠假單胞菌質(zhì)控品的瓶子打開，樣品開啟后加入5 mL滅菌去離子水溶解混勻，然后轉(zhuǎn)移至裝有980 mL滅菌去離子水的三角瓶中。隨后，樣品瓶中再加入5 mL滅菌去離子水進(jìn)行潤(rùn)洗，潤(rùn)洗液轉(zhuǎn)移至該三角瓶，潤(rùn)洗步驟重復(fù)3次。最終可得到1 L原液。

1.4.2 樣品稀釋

250 mL原液用于直接檢測(cè)，剩余原液用于10倍系列稀釋后檢測(cè)。10倍系列稀釋方法是取100 mL原液加入900 mL滅菌去離子水，混勻得到稀釋10倍的樣品稀釋液，以此方法稀釋到10-4。

1.4.3 樣品過濾

樣品在100級(jí)的潔凈工作臺(tái)進(jìn)行過濾操作。首先將0.45 ?m孔徑的薄膜過濾器固定在集菌儀上，然后開始抽吸水樣，等濾膜濕潤(rùn)后，將薄膜過濾器通氣孔關(guān)閉，開始過濾。薄膜過濾器內(nèi)水樣完全過濾后，使用無菌鑷子小心地從濾膜邊緣將過濾后的濾膜夾起，平鋪到CN瓊脂平板上，集菌的濾膜面朝上。

1.4.4 培養(yǎng)

把CN平板倒置，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)，（36±1） ℃培養(yǎng)24～48 h。在培養(yǎng)過程中勤于觀察，可分別在20～24 h和40～48 h觀察濾膜上菌落的生長(zhǎng)情況及計(jì)數(shù)。同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CN平板觀察與計(jì)數(shù)

按照盲樣作業(yè)指導(dǎo)書和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》（GB 8538—2016）操作，從原液至10-4稀釋度進(jìn)行取樣檢測(cè)，TL048樣品在原液、10-1、10-2稀釋度的平板中只生長(zhǎng)出一種特征的典型菌落，為綠色菌落，沒有其他可疑菌落生長(zhǎng)，結(jié)果見表1。

2.2 確證性實(shí)驗(yàn)

TL048考核樣品在稀釋10倍的CN平板上只生長(zhǎng)綠色菌落。在暗室中，將紫外儀波長(zhǎng)365 nm的開關(guān)打開，紫外燈照CN平板，發(fā)現(xiàn)綠色菌落產(chǎn)熒光，注意不可長(zhǎng)時(shí)間紫外燈照射，以免影響菌落生長(zhǎng)。將綠色菌落轉(zhuǎn)接到綠膿菌素斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行綠膿菌素抽提實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示綠膿菌素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，則判定該綠色菌落是銅綠假單胞菌。同時(shí)，使用VITEK2進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果顯示99%為銅綠假單胞菌。最終菌落計(jì)數(shù)為2.6×102 CFU/250 mL，見表2。

3 結(jié)論與討論

本次盲樣考核樣品，飲用水中銅綠假單胞菌定量檢驗(yàn)在CN平板計(jì)數(shù)報(bào)告結(jié)果為2.6×102 CFU/250 mL，Z值小于2，評(píng)價(jià)結(jié)果滿意。由此可見該實(shí)驗(yàn)室具備銅綠假單胞菌定量檢測(cè)的能力。

自2019年以來，《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》將銅綠假單胞菌指標(biāo)作為包裝飲用水的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一。目前《食品安全國(guó)家 包裝飲用水》（GB 19298—2014）標(biāo)準(zhǔn)要求的銅綠假單胞菌檢驗(yàn)項(xiàng)目為定量檢驗(yàn)，按照二級(jí)采樣方案，每批次5份水樣品，每份水樣都不得檢出（0 CFU/250 mL），如檢出，則判定為不合格，由此看出，銅綠假單胞菌的定量檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制的一項(xiàng)重要項(xiàng)目。所以，在進(jìn)行盲樣考核等實(shí)驗(yàn)過程中，以下問題應(yīng)該引起人們的注意。①實(shí)驗(yàn)前認(rèn)真閱讀作業(yè)指導(dǎo)書，作業(yè)指導(dǎo)書對(duì)本次盲樣考核的樣品、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果記錄等有特別要求。例如，本次盲樣考核要求樣品每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行，按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行梯度稀釋，而《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》（GB 8538—2018）檢驗(yàn)方法中未有明確要求。②實(shí)驗(yàn)前做好準(zhǔn)備工作，包括儀器設(shè)備的校準(zhǔn)、試運(yùn)行以及培養(yǎng)基試劑是否齊全。有條件的實(shí)驗(yàn)室可以購(gòu)買質(zhì)控樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，提前發(fā)現(xiàn)問題并進(jìn)行解決。③定量檢測(cè)項(xiàng)目一般在作業(yè)指導(dǎo)書中表明樣品含量水平，可多做幾個(gè)稀釋度，確保結(jié)果準(zhǔn)確。④保持CN平板表面干燥，防止菌落蔓延生長(zhǎng)，將過濾膜貼在平板上時(shí)要保持平整，不能留有空隙，避免后續(xù)影響銅綠假單胞菌計(jì)數(shù)。⑤銅綠假單胞菌在生化鑒定時(shí)，由于國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，可借助VITEK2鑒定儀輔助鑒定，進(jìn)而提高鑒定效率。⑥銅綠假單胞菌在培養(yǎng)48 h后，菌落生長(zhǎng)較大，容易連成片，不易觀察計(jì)數(shù)。因此，可在培養(yǎng)20～24 h和40～48 h后分別觀察濾膜上菌落的生長(zhǎng)情況。⑦按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行樣品梯度稀釋時(shí)，若樣品總體積為1 L，則應(yīng)選取2 L的三角瓶或無菌均質(zhì)袋，確保水樣能夠徹底混合均勻。⑧銅綠假單胞菌為條件致病菌，實(shí)驗(yàn)所用的量筒、三角瓶和薄膜過濾器等應(yīng)121 ℃高壓滅菌30 min以上，按照規(guī)定處理，防止污染環(huán)境。

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