顧張弘， 姚 響， 王錦思， 張耀鵬

(1. 東華大學 纖維材料改性國家重點實驗室， 上海 201620； 2. 東華大學 材料科學與工程學院， 上海 201620)

細胞外基質(zhì)(ECM)中多種重要組分均為纖維狀結構，如膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白等[1-3]，其為細胞的黏附、生長、遷移和分化等行為提供了重要的生物和物理支撐[4]。纖維狀材料因具有仿ECM結構的特征，在生物醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景[4-6]。研究細胞-纖維材料的相互作用規(guī)律有助于推動新一代生物材料的開發(fā)。

靜電紡絲具有裝置簡單、工藝可控等優(yōu)點，已成為高效制備生物纖維材料的主要途徑之一[7-9]。目前，已有研究利用靜電紡絲技術，從纖維聚集體層面考察并證實了纖維直徑、支架孔徑、纖維的單一取向排布與無規(guī)則排布等特征能夠對細胞的黏附和分化等行為產(chǎn)生明顯影響[10-12]。然而，相關研究中均存在明顯背景黏附干擾，如細胞透過纖維間空隙與背景基底材料的黏附干擾和細胞跨越周圍臨近多根纖維間的黏附干擾等。這些背景黏附干擾的存在混雜了多因素對細胞行為的影響，極有可能會干擾纖維自身特征對細胞行為的影響，導致難以準確揭示細胞-纖維相互作用規(guī)律。目前，由于缺乏有效的纖維材料平臺，鮮有研究報道在完全排除背景黏附干擾的基礎上考察纖維特征對細胞行為的影響。

具有細胞黏附反差特性的圖案化技術提供了一種獨特而強大的工具來了解細胞與材料間的相互作用規(guī)律[13-15]，其最大優(yōu)勢便在于能夠在排除干擾因素的條件下獨立考察材料自身特征對細胞黏附等行為的影響，這對生物材料的開發(fā)和發(fā)展均具有重要意義[16-18]。本文選用具有良好生物相容性的絲素蛋白(SF)纖維為模型材料，利用寡聚乙二醇硅烷化試劑(MPTES)在玻片表面自組裝接枝，制備具有優(yōu)秀抗細胞黏附特征的基底材料；結合SF濕法紡絲技術在基底表面制備可黏附細胞的單層平行纖維，借助生物相容性良好的聚二甲基硅氧烷將SF纖維兩端固定于基底邊緣，從而制備具有細胞黏附反差特性的單層平行纖維圖案。在此基礎上，驗證了纖維圖案的細胞黏附反差特性。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

家蠶繭，產(chǎn)地浙江桐鄉(xiāng)；碳酸鈉、溴化鋰、甲苯，上海凌峰化學試劑有限公司；透析袋，上海源聚生物科技有限公司；乙醇、濃硫酸、30%過氧化氫，國藥集團化學試劑有限公司;寡聚乙二醇硅烷化試劑(乙二醇鏈段數(shù)為6～9，MPTES)，美國Gelest公司；三乙胺，上海強順化工有限公司；聚二甲基硅氧烷(PDMS)有機硅彈性體雙組分套件，美國道康寧公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，美國Hyclone公司；胰蛋白酶、培養(yǎng)基(低糖DMEM)、澳洲胎牛血清、青鏈霉素混合液(雙抗)，美國Gibco公司；多聚甲醛、FITC標記的鬼筆環(huán)肽熒光染料、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光染料、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(Trition X-100)，美國Sigma公司；玻片(尺寸為23 mm×26 mm)，江蘇飛舟玻塑有限公司。

1.2 具有抗細胞黏附特性的玻片基底制備

將MPTES接枝到潔凈的玻片表面進行修飾處理，使其具有抑制細胞黏附的功能。具體步驟如下：1)使用濃硫酸和30%過氧化氫按體積比為7∶3配制的食人魚溶液浸泡潔凈的玻片，處理30 min后用超純水超聲波清洗干凈，氮氣吹干備用；2)將玻片放入DT-01型低溫等離子體處理儀，氣氛為氧氣，在功率為100 W，真空度為30 Pa的條件下處理15 min后取出玻片，立即放入超純水中浸泡15 min，氮氣吹干備用；3)將玻片放入盛有反應液的密閉反應容器中，在氮氣氛圍保護下反應2 d，反應溫度維持在60 ℃左右。反應液中溶劑為甲苯，MPTES濃度為6 mmol/L，催化劑為體積分數(shù)為1%的三乙胺。

1.3 SF紡絲液制備

SF濕法紡絲水溶液參照文獻[19]制備。首先采用質(zhì)量分數(shù)為0.5%的碳酸鈉溶液對家蠶繭脫膠處理30 min；再利用溴化鋰(9 mol/L)溶液在40 ℃下溶解脫膠絲，得到質(zhì)量分數(shù)約為10%的SF水溶液；最后，將所得SF溶液經(jīng)離心、抽濾后透析3 d以除去鹽離子，通過低溫對流吹風濃縮溶液至33%備用。

1.4 單層平行SF纖維圖案的制備

采用濕法紡絲工藝制備了2種直徑的單層平行纖維圖案。首先，將SF紡絲液經(jīng)內(nèi)徑為0.41 mm的針頭擠出后，經(jīng)體積分數(shù)為90%的乙醇水溶液凝固浴固化，最后卷繞于收集輥。收集輥上固定有接枝MPTES的玻片。實驗過程中通過控制纖維沿收集輥的軸向運動來調(diào)控纖維間間距。小直徑纖維圖案的制備參數(shù)為噴絲口流量16 μL/min、牽伸速度1.6 cm/s。大直徑纖維圖案的制備參數(shù)為：噴絲口流量30 μL/min、牽伸速度1.2 cm/s。

在基底材料上制備好單層平行排布的纖維材料后，將PDMS預聚物和配套交聯(lián)劑以10∶1的質(zhì)量比混合均勻后涂覆于單層平行排列纖維兩端與基底結合的部位，隨后在70 ℃下交聯(lián)固化30 min，從而將纖維與基底緊密固定，最終獲得具有細胞黏附反差特性的單層平行纖維圖案。根據(jù)纖維直徑大小將2組圖案分別命名為小直徑(S-SF)纖維圖案和大直徑(L-SF)纖維圖案。纖維圖案構成示意圖如圖1所示。

圖1 具有細胞黏附反差特性的單層平行纖維圖案組成示意圖Fig.1 Schematic diagram to show component of single-layer and parallel arranged fiber pattern with cell adhesion contrast properties

1.5 纖維圖案與纖維結構特征表征

將纖維圖案樣本置于DMi8倒置相差顯微鏡下進行圖像采集以評估纖維的排布、直徑及纖維間間距。纖維的直徑及間距由Image J軟件進行測量分析獲得，單個樣品選取100處進行測量，取平均值。利用FlexSEM1000Ⅱ掃描電子顯微鏡(SEM)對纖維形貌進行表征。將制備好的樣品干燥后噴金(電流為10 mA，時間為90 s)處理，在10 kV的電壓下觀察纖維的微觀形貌。

利用Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析儀對纖維組成結構進行表征，在4 cm-1分辨率下累計掃描32次，記錄4 000～600 cm-1范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)。利用PeakFit軟件對酰胺Ⅰ區(qū)(1 720～1 580 cm-1)晶型分峰擬合，分別計算2種直徑的纖維中β-折疊、β-轉角、無規(guī)卷曲/螺旋構象的含量。為減小實驗誤差，測試樣品不少于3個，實驗結果用平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)采用Origin 9.0中的單因素ANOVA法進行統(tǒng)計學分析，概率值p<0.05表示結果具有顯著性差異。

1.6 細胞的傳代培養(yǎng)及其在材料上的接種

L929成纖維細胞培養(yǎng)液由低糖DMEM培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清、雙抗按100∶10∶1的體積比配制。將含有L929成纖維細胞的培養(yǎng)液置于37 ℃、5%CO2含量的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d全量更換培養(yǎng)液，待細胞長滿約培養(yǎng)瓶80%后進行細胞傳代。

分別將修飾前后的玻片基底以及單層平行纖維圖案置于六孔板中(每孔放置1個圖案)，隨后利用定制的聚四氟乙烯環(huán)將圖案壓緊固定在六孔板底部。然后將L929成纖維細胞接種到酒精滅菌后的玻片基底和纖維圖案材料上，每孔添加2 mL細胞懸浮液，細胞密度為5萬個/mL，隨后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，細胞黏附2～3 h后吸棄未黏附的懸浮細胞，每孔加入2 mL的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 細胞在材料上的黏附狀態(tài)觀察

1)細胞在未修飾玻片和修飾玻片基底表面的黏附狀態(tài)觀察。L929成纖維細胞在材料上黏附培養(yǎng)1 d后，用PBS潤洗2次，使用4%的多聚甲醛溶液固定細胞15 min；然后用PBS潤洗2次后加入0.1%的Triton X-100處理5 min以達到破膜效果；再用PBS潤洗2次后加入鬼筆環(huán)肽水溶液(質(zhì)量濃度為1 μg/mL)對細胞骨架染色30 min；繼續(xù)用PBS潤洗2次后加入DAPI染液(質(zhì)量濃度為10 μg/mL)對細胞核染色5 min；最后經(jīng)PBS潤洗后，將染色樣品置于倒置相差顯微鏡的熒光模式下進行觀察。

2)細胞在平行纖維圖案上的黏附狀態(tài)觀察。將L929成纖維細胞在纖維圖案材料上黏附培養(yǎng)1 d后，置于倒置相差顯微鏡上觀察纖維圖案上的細胞黏附情況。為進一步清楚地觀察細胞在纖維圖案上的黏附狀態(tài)，隨機選取部分樣品采用SEM進行觀察：將細胞在纖維圖案材料上黏附培養(yǎng)1 d后移除培養(yǎng)液，用PBS清洗后將體積分數(shù)為2.5%的多聚甲醛溶液加入孔板處理2 h以固定細胞；隨后，將固定液移除用PBS潤洗3次，以除去殘余多聚甲醛；然后依次使用梯度體積分數(shù)的乙醇水溶液(體積分數(shù)依次為30%、50%、70%、75%、80%、90%和100%)對固定后的樣品進行脫水處理，每種體積分數(shù)下浸泡10 min；最后，移去乙醇溶液后加入叔丁醇，于-60 ℃冰箱中冷凍過夜后取出，使用冷凍干燥機對樣品進行凍干處理，溫度為-60 ℃，將凍干樣品表面噴金(10 mA，60 s)處理后使用SEM觀察細胞黏附特性。

2 結果與討論

2.1 基底材料抗細胞黏附修飾及功能驗證

通常抗細胞黏附功能的實現(xiàn)主要是通過減少蛋白質(zhì)在基底表面的吸附，有效方法之一便是利用聚乙二醇(PEG)對材料進行合理修飾，例如使用PEG水凝膠或分子鏈相對較長的寡聚乙二醇單分子自組裝層能夠表現(xiàn)出優(yōu)秀的抗細胞黏附功能[18,20-21]。為了獲得具有優(yōu)秀抗細胞黏附特性的基底材料，本文選用MPTES對潔凈玻片基底進行接枝修飾，以獲得具有抗細胞黏附作用的基底材料。MPTES一端帶有硅氧烷基，另一端帶有寡聚乙二醇鏈段。經(jīng)氧氣等離子體處理的玻片基底表面會形成大量羥基，這些羥基在接枝過程中可與MPTES中的硅氧烷基共價結合，進而在潔凈玻片基底表面形成一層牢固的寡聚乙二醇單分子層，從而賦予基底材料良好的抗細胞黏附特性。

L929成纖維細胞在未修飾和經(jīng)MPTES接枝修飾后玻片基底表面接種黏附1 d后的熒光染色照片如圖2所示。由圖2(a)可以看到，在未修飾的玻片基底表面細胞黏附正常，存在大量的細胞核和明顯的細胞骨架。而在接枝修飾后的玻片基底表面則觀察不到明顯的細胞核和細胞骨架(見圖2(b))，僅有極少量細胞黏附且細胞鋪展較差，表明經(jīng)過MPTES接枝修飾后的玻片基底具有優(yōu)異的抗細胞黏附功能。

圖2 細胞在MPTES修飾接枝前后玻片基底表面的黏附情況Fig.2 Cell adhesion on glass surfaces before (a)and after (b)MPTES grafting modification

2.2 單層平行纖維圖案的性能分析

SF由于其擁有優(yōu)異的生物相容性，可控的降解性，優(yōu)良的加工性等優(yōu)點，已有多種SF基纖維狀支架材料應用于再生醫(yī)學及組織工程領域[22-24]。在SF的多種成形加工方法中，濕法紡絲技術能夠較為簡便地獲得具有不同直徑尺寸的纖維材料[24-26]。本文制備的2種不同直徑的纖維圖案，如圖3所示，相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表1?？梢钥闯?，纖維材料呈現(xiàn)明顯的單層、平行排布特征。基于倒置相差顯微鏡圖像的統(tǒng)計分析得出，2組纖維的平均直徑分別約為83和129 μm，說明通過紡絲流量及牽伸速度的改變可以調(diào)控纖維直徑。此外，為了避免細胞在常規(guī)圖案間的跨越黏附，圖案間的間距需大于70～100 μm[27]，因此，本文調(diào)控纖維圖案中纖維間的間距均大于100 μm。測量結果表明，S-SF和L-SF纖維圖案中纖維間的平均間距分別約為194和160 μm。綜上所述，本文成功實現(xiàn)了預設單層平行纖維圖案的制備，且纖維直徑和間距可調(diào)。

圖3 2種不同直徑單層平行纖維圖案的相差顯微圖像Fig.3 Phase contrast micrographs of single-layer and parallel arranged fiber patterns with different diameters

表1 2種單層平行纖維圖案中的纖維直徑及纖維間間距統(tǒng)計結果Tab.1 Statistical results of fiber diameter and fiber spacing of single-layer and parallel arranged fiber patterns

材料表面的微納米結構和軟硬程度等因素已被證明能夠調(diào)控細胞的黏附和生長，進一步影響后期細胞的分化等行為[4]。基于此，本文利用掃描電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜儀分別考察了2種圖案中SF纖維的形貌和構象。小直徑和大直徑纖維圖案中對應的纖維形貌照片如圖4所示?？梢姡w維圖案中小直徑纖維和大直徑纖維的表面均較為光滑,但由于紡絲過程中存在一定的拉伸作用，在2種纖維表面均呈現(xiàn)出了類似的沿纖維拉伸方向取向的溝壑狀結構。

圖4 不同直徑單層平行纖維圖案中SF纖維的SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM images of SF fibers in single-layer and parallel arranged fiber patterns with different diameters

注：“△”表示單因素ANOVA分析中的概率值 p>0.05，無顯著差異。圖5 不同直徑單層平行纖維圖案中SF纖維的紅外光譜圖和二級結構含量統(tǒng)計結果Fig.5 FT-IR spectrum (a) and statistical results of secondary structure contents (b) of SF fibers in single-layer and parallel arranged fiber patterns

2.3 細胞黏附反差功能分析

結合具有抗細胞黏附特性的基底和可細胞黏附的SF纖維，本文構筑了一種具有細胞黏附反差功能的單層平行SF纖維圖案，該圖案平臺具有在排除各類背景黏附干擾的基礎上考察纖維特征對細胞行為影響的潛力。為了驗證典型單層平行纖維圖案的細胞黏附反差功能，將L929成纖維細胞接種到小直徑單層平行纖維圖案表面，同時選取基底未經(jīng)抗細胞黏附修飾的纖維圖案作為對照組對比。L929成纖維細胞接種到纖維圖案上黏附生長1 d后的相差顯微鏡照片和SEM照片如圖6所示?？芍?，在相差圖像中，未修飾處理對照組圖案的背景基底上有明顯的細胞黏附，而經(jīng)過MPTES修飾處理圖案組的基底上未見明顯的細胞黏附。由于在相差圖像中較難分辨纖維上是否有明顯細胞黏附，進一步利用SEM對纖維圖案微區(qū)進行觀察。在對照組中，可以清楚地看到細胞在纖維材料及未處理基底表面均有明顯的黏附，而在背景經(jīng)過修飾處理后的單層平行纖維圖案表面，細胞僅能在纖維上發(fā)生黏附和伸展，而在背景區(qū)域則無明顯的細胞黏附。另外，由于黏結纖維端部與基底邊緣部位所選的材料為具有良好生物相容性的PDMS，因而對體系中待考察的細胞無毒無害，細胞在能夠黏附的區(qū)域均體現(xiàn)出了較好的黏附生長狀態(tài)，這為后續(xù)考察細胞-纖維材料相互作用提供了極大便利。

圖6 L929成纖維細胞在基底未修飾處理和修飾處理后的單層平行纖維圖案上的黏附情況Fig.6 Adhesion of L929 cells on single-layer and parallel arranged fiber patterns with unmodified or modified substrate.(a)Inverted phase contrast microscope images; (b)SEM images

上述結果表明，本文制備的單層平行纖維圖案具有優(yōu)秀的細胞黏附反差特性，即細胞僅能黏附到纖維材料上，而不能黏附到基底表面。另外，由于纖維呈單層平行排布特征，也有效排除了傳統(tǒng)材料平臺中細胞在上下纖維間的跨越黏附干擾，較大的纖維間間距(大于100 μm)亦可排除細胞在左右纖維間的跨域黏附干擾。這種單層平行纖維圖案能夠有效排除各類背景黏附的干擾，在考察纖維特征對細胞行為的影響及細胞-纖維相互作用方面具有明顯的優(yōu)勢和潛力。

3 結 論

本文制備了2種不同直徑的具有細胞黏附反差特性的單層平行絲素蛋白纖維圖案，通過分析得知纖維直徑及纖維間間距可通過工藝調(diào)控，利用寡聚乙二醇硅烷化試劑接枝修飾后的玻片基底具有優(yōu)秀的抗細胞黏附特性。所制備的單層平行纖維圖案具有優(yōu)秀的細胞黏附反差特性，在排除各類背景黏附干擾的基礎上，可獨立考察纖維自身特征對細胞行為的影響，為深入揭示細胞-纖維相互作用規(guī)律提供了有效的材料平臺。

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