劉 燕，朱 莉，田 冰

湖南省常德市婦幼保健院病理科，湖南常德 415000

宮頸癌是女性較為常見(jiàn)的腫瘤。全球范圍內(nèi)，宮頸癌每年約50萬(wàn)新發(fā)病例，每年死亡例數(shù)高達(dá)26萬(wàn)例[1]。臨床上，宮頸癌的治療以手術(shù)治療為主，近年來(lái)，靶向藥物和免疫檢查抑制劑在臨床的廣泛使用，使腫瘤患者獲得良好的治療療效及生存預(yù)后[2]。但在治療過(guò)程中宮頸癌患者仍存在治療抵抗或不敏感的現(xiàn)象[3]。深入研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，對(duì)宮頸癌的診斷和治療意義重大。多形性腺瘤基因樣鋅指因子1(Zac1)的編碼基因位于人類6號(hào)染色體，該基因蛋白具有典型的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)。Zac1在胚胎組織及女性子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)較高。腫瘤中Zac1主要發(fā)揮抑癌基因作用。研究表明，在肝癌[4]、結(jié)直腸癌[5]和腎細(xì)胞癌[6]等惡性腫瘤中Zac1表達(dá)下調(diào)，引起腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致腫瘤患者的預(yù)后不良[5]。淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1(LEF1)的編碼基因位于4q25，該基因編碼蛋白能結(jié)合并激活T細(xì)胞受體-α增強(qiáng)子，在細(xì)胞分化和毛囊形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮作用[7]。LEF1在前列腺癌[8]、膀胱癌[9]等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)激活Wnt途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[10]。本研究通過(guò)檢測(cè)宮頸癌中Zac1、LEF1的表達(dá)，分析兩者與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，探討Zac1、LEF1的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年5月至2017年5月于本院診治的83例宮頸癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸癌，由兩位病理醫(yī)師共同診斷；(2)無(wú)放化療史；(3)宮頸癌患者一般狀況良好，卡氏功能狀態(tài)評(píng)分>70分。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤；(2)合并宮頸良性病變；(3)合并重度臟器功能衰竭。宮頸癌患者年齡32～75歲，平均(47.1±5.3)歲；宮頸鱗癌60例，宮頸腺癌23例；高中分化50例，低分化33例；腫瘤FIGO分期：Ⅰ期55例，Ⅱ期28例；肌層浸潤(rùn)深度：淺肌層54例，深肌層29例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例。所有宮頸癌患者均簽署知情同意書(shū)，符合赫爾辛基宣言原則，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。所有宮頸癌患者出院后均予以隨訪，以門(mén)診或電話方式進(jìn)行，隨訪內(nèi)容包括生存情況等。隨訪終止日期2021年5月，隨訪3～48個(gè)月，中位隨訪時(shí)間31.2個(gè)月。

1.2方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)，取術(shù)中黃豆粒大小宮頸癌組織和癌旁組織，癌旁組織距癌組織2 cm以上，經(jīng)病理檢查明確為正常宮頸組織，組織來(lái)源與宮頸癌來(lái)源一致。實(shí)驗(yàn)前稱取50 mg組織，組織研缽研磨后，離心去除細(xì)胞碎片。用Trizol試劑提取組織中RNA，溶于DEPC水，用Narodrop2000檢測(cè)RNA濃度。以RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成模板cDNA。然后以cDNA為模板，利用qPCR檢測(cè)Zac1、LEF1 mRNA的表達(dá)。Zac1上游引物：5′-CCCAGAAATCTCACCAGTGTG-3′，Zac1下游引物：5′-GTGCCTCTTATAGCCCAGCAT-3′，LEF1上游引物:5′-TGCCAAATATGAATAACGACCCA-3′，LEF1下游引物:5′-GAGAAAAGTGCTCGTCACTGT-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-CTGGGCTATAAGAGGCACCTG-3′，內(nèi)參GAPDH下游引物:3′-CTTTTCCTTGGTTCCGCTAGG-5′。qPCR引物的設(shè)計(jì)合成由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司完成。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性40 s，62 ℃退火1 min，70 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。qPCR反應(yīng)總體系為10 μL，模板1 μL，前后引物各1 μL，SYBR premix Taq Ⅱ 5 μL，去離子水2 μL。每個(gè)標(biāo)本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Zac1、LEF1的相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，ΔCt= CT目的基因-CTGAPDH；ΔΔCt=CT樣品-CT對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌組織和癌旁組織Zac1和LEF1相對(duì)表達(dá)水平比較 宮頸癌組織與癌旁組織中Zac1的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.831±0.134、4.613±0.347，LEF1的相對(duì)表達(dá)水平分別為5.212±0.457、0.968±0.131。宮頸癌中Zac1的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(t=92.629，P<0.001)，宮頸癌中LEF1的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(t=81.330，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 宮頸癌組織和癌旁組織中Zac1和LEF1相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2Zac1與LEF1表達(dá)之間的相關(guān)性 結(jié)果表明Zac1與LEF1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.570，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 Zac1與LEF1表達(dá)之間的相關(guān)性

2.3Zac1、LEF1表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 宮頸癌中Zac1、LEF1的相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤FIGO分期Ⅱ期癌組織中Zac1的表達(dá)明顯低于FIGO分期Ⅰ期(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中Zac1的表達(dá)明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。腫瘤FIGO分期Ⅱ期癌組織中LEF1的表達(dá)明顯高于FIGO分期Ⅰ期(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中LEF1的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 Zac1、LEF1的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4Zac1、LEF1的表達(dá)與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 本研究中，對(duì)83例宮頸癌患者進(jìn)行隨訪，隨訪過(guò)程中無(wú)失訪，死亡22例，生存率為73.5%(61/83)。以Zac1相對(duì)表達(dá)水平的平均數(shù)0.831為臨界值，分為低Zac1表達(dá)組42例，高Zac1組41例。低Zac1表達(dá)組生存率為61.9%(26/42)，明顯低于高Zac1表達(dá)組的85.4%(35/41)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.801，HR=1.79，95%CI1.13～2.84，P=0.016)。以LEF1相對(duì)表達(dá)水平的平均數(shù)5.212為臨界值，低LEF1表達(dá)組40例，高LEF1表達(dá)組43例。高LEF1表達(dá)組生存率為67.4%(29/43)，明顯低于低LEF1表達(dá)組的80.0%(32/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.431，HR=1.66，95%CI1.04～2.63，P=0.035)。見(jiàn)圖3。

2.5多因素COX回歸分析宮頸癌患者生存預(yù)后的影響因素 以宮頸癌患者的生存情況為因變量(賦值1=死亡，0=存活)，納入FIGO分期(賦值1=Ⅰ期，2=Ⅱ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值1=伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，0=無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、Zac1(賦值1=低表達(dá)，2=高表達(dá))、LEF1(賦值1=高表達(dá)，2=低表達(dá))為自變量。多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，Zac1低表達(dá)(HR=2.473，95%CI1.560～4.610)，LEF1高表達(dá)(HR=1.780，95%CI1.091～2.283)，F(xiàn)IOG分期Ⅱ期(HR=1.731，95%CI1.112～2.502)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=2.810，95%CI1.353～4.816)是宮頸癌患者生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2。

注：A為Zac1相對(duì)表達(dá)水平與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系；B為L(zhǎng)EF1相對(duì)表達(dá)水平與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系。圖3 Zac1、LEF1相對(duì)表達(dá)水平與宮頸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

表2 影響宮頸癌患者生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素

3 討 論

我國(guó)是宮頸癌發(fā)病率較高的國(guó)家，每年發(fā)病率高達(dá)16.6/100 000，嚴(yán)重威脅我國(guó)女性的身體健康[11]。隨著我國(guó)宮頸癌篩查的普及和人乳頭瘤病毒疫苗的推廣，使得早期預(yù)防宮頸癌成為可能。但對(duì)于轉(zhuǎn)移性宮頸癌及復(fù)發(fā)性宮頸癌患者，傳統(tǒng)的手術(shù)及放化療療效較差，5年生存率僅有60%[12]。因此，深入探討宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制，尋找新的診斷治療靶點(diǎn)，對(duì)于指導(dǎo)宮頸癌患者的個(gè)體化治療，具有重要的意義。

Zac1由PLAGL1基因編碼，是含有7個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在多種類型的胚胎組織和子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá)。功能上，Zac1作為轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯中發(fā)揮重要調(diào)控功能[13]。例如，Zac1可以與核受體(如p53和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶)結(jié)合并促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[14]。因此，在腫瘤中Zac1是一種重要的腫瘤抑制因子。本研究宮頸癌患者中Zac1的相對(duì)表達(dá)水平降低。目前在腫瘤中調(diào)控Zac1表達(dá)的機(jī)制還不清楚。LE等[15]發(fā)現(xiàn)，Zac1受miR-125b的表達(dá)調(diào)控，腫瘤中miR-125b表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)Zac1 mRNA的降解，抑制Zac1的表達(dá)。此外，Zac1的表達(dá)還受到表觀遺傳學(xué)修飾的調(diào)控，腫瘤中Zac1基因啟動(dòng)區(qū)域CpG島處的高甲基化，能夠明顯抑制Zac1的表達(dá)[16]。進(jìn)一步研究Zac1在宮頸癌中表達(dá)的臨床意義發(fā)現(xiàn)，Zac1的低表達(dá)與宮頸癌較高的腫瘤FIGO分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Zac1的低表達(dá)促進(jìn)宮頸癌的腫瘤進(jìn)展。SU等[16]研究表明，腫瘤中Zac1的表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高宮頸癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤中Zac1的低表達(dá)導(dǎo)致其促進(jìn)p53蛋白轉(zhuǎn)錄的能力降低，細(xì)胞周期阻滯能力喪失，腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖，致使腫瘤分期升高[14]。因此，Zac1表達(dá)的降低與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。本研究利用Kaplan-Meier生存分析亦證實(shí)Zac1低表達(dá)的宮頸癌患者生存預(yù)后較差，并且多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型亦證實(shí)Zac1低表達(dá)是宮頸癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，檢測(cè)Zac1的表達(dá)是評(píng)估宮頸癌患者預(yù)后的新型生物標(biāo)志物，針對(duì)Zac1的治療可能是一種能夠改善患者預(yù)后的治療方案，值得深入研究。

LEF1屬于高遷移率家族的成員，主要通過(guò)改變DNA螺旋結(jié)構(gòu)參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在細(xì)胞的分化及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。LEF1在各種類型的癌癥中異常表達(dá)，包括食管鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌和肝細(xì)胞癌等，并通過(guò)促進(jìn)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[17]。本研究宮頸癌患者中LEF1的相對(duì)表達(dá)水平升高，分析其機(jī)制可能與腫瘤中Wnt信號(hào)通路的過(guò)度激活有關(guān)。Wnt/β-Catenin通路在許多癌癥的致瘤特性中起著關(guān)鍵作用。研究表明，LEF1是Wnt/β-Catenin通路的下游調(diào)節(jié)因子，有利于維持腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性、腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生[18]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LEF1高表達(dá)與宮頸癌較高的腫瘤FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示宮頸癌中LEF1的高表達(dá)促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展。一方面，LEF1能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，致使E-鈣黏素表達(dá)降低，而N-鈣黏素表達(dá)升高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞黏附能力降低，遷移能力增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。另一方面，WANG等[19]研究表明，LEF1能夠通過(guò)激活癌基因HRAS的表達(dá)，激活ERK/MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖。因此，本研究證實(shí)，LEF1在宮頸癌中可能作為一種促癌基因，促進(jìn)宮頸癌的腫瘤進(jìn)展。本研究通過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者中LEF1高表達(dá)的患者生存預(yù)后較差，并且是宮頸癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明檢測(cè)宮頸癌癌組織中LEF1的表達(dá)對(duì)宮頸癌具有重要的預(yù)后價(jià)值。此外，針對(duì)LEF1的靶向治療可作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。PARK等[20]報(bào)道，LEF1的抑制劑氯硝柳胺能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的干性特性，對(duì)腫瘤起到治療作用。

本研究采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌中Zac1與LEF1的相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。目前兩者的關(guān)系尚不清楚，可能是兩者在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中存在一定的協(xié)同作用。FREIHEN等[21]報(bào)道，宮頸癌中Zac1基因處于高度甲基化的狀態(tài)導(dǎo)致Zac1的表達(dá)降低，進(jìn)而誘導(dǎo)Wnt通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如Snail的表達(dá)上調(diào)，Snail激活下游分子LEF1的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。但兩者之間的相互作用關(guān)系及在宮頸癌中的具體機(jī)制仍有待深入研究。

綜上所述，宮頸癌中Zac1表達(dá)降低，LEF1表達(dá)升高，兩者的表達(dá)與腫瘤FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Zac1低表達(dá)、LEF1高表達(dá)、腫瘤FIGO分期Ⅱ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，檢測(cè)宮頸癌癌組織中Zac1、LEF1的表達(dá)是判斷宮頸癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。但兩者的臨床應(yīng)用價(jià)值仍需多中心、大樣本的深入研究。