何軼群，黃文輝，李 娟，趙玲莉，張 翔，楊世聞

青海大學附屬醫(yī)院檢驗科，青海西寧 810001

近年來耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)引起的院內和社區(qū)感染越來越多，其病死率也越來越高。CRE引起的感染在臨床治療上不僅不好治愈而且病死率較高[1-2]。CRE可通過患者與患者、患者與醫(yī)護人員之間進行相互傳播，不僅嚴重威脅患者的生命健康，而且造成醫(yī)療資源的浪費和患者經濟負擔的加重。及時對院內CRE進行同源性分析，是判斷其是否存在院內感染及確定傳染源的關鍵。目前用于細菌同源性分析的方法多采用多位點序列分型(MLST)方法。MLST的優(yōu)點是重復性好，分辨力高，易于標準化，并可直接進行分析[3-4]，缺點是要提前知道待測菌株基因組序列，并查詢該菌株相對應的管家基因。此外檢測的高額費用和所需特定的儀器使得MLST只能局限在大型的流行病學研究中心，不適用于醫(yī)院等中小范圍的流行病學分析?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是近年來快速發(fā)展起來的一種新型微生物鑒定技術，自2010年質譜技術進入國內后得到了飛速發(fā)展[5-8]。MALDI-TOF MS主要是分析比較細菌的蛋白質指紋圖譜，其最大特點是快速、簡單、方便，可在幾分鐘內完成病原菌的同源性分析[9-10]。本研究通過對青海大學附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科分離的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌，以及同期其他科室分離的6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌進行MALDI-TOF MS和MLST同源性分析，通過比較評價MALDI-TOF MS在高原地區(qū)用于CRE同源性分析的能力，從而為高原地區(qū)醫(yī)院感控工作提供一種快速、便捷、經濟的同源性分析方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 收集青海大學附屬醫(yī)院2020年1月分離的肺炎克雷伯菌，其中5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌來自重癥醫(yī)學科，碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌采用金山川免疫顯色表型檢測卡進行確認，經確認均為KPC酶型的CRE，6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌來自其他科室。肺炎克雷伯菌ATCC10031由本實驗室保存。

1.1.2培養(yǎng)基 實驗所用的血瓊脂平板來自賽默飛世爾生物化學制品(北京)公司有限公司。

1.2儀器與試劑 甲酸、HCCA基質、三氟乙酸、乙腈購于德國布魯克公司，PCR實驗所需試劑全部購于上海生工生物工程有限公司。MALDI-TOF MS(德國布魯克)，PCR擴增儀(美國Bio-rad)，ViteK 2 Compact全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)(法國梅里埃)，凝膠成像儀(美國Bio-rad)，電泳儀(北京六一)。

1.3方法

1.3.1MLST 將保存于-20 ℃冰箱的菌株凍存管中的待測肺炎克雷伯菌轉種于血瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h后備用。采用煮沸法提取細菌基因組，具體步驟：無菌挑取備用菌株于400 μL的無菌蒸餾水中煮沸10 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液做細菌模板DNA。肺炎克雷伯菌7對管家基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB，參考MLST網址https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html中提供的方法進行擴增，擴增序列上傳MLST網站進行比對，得到相應的細菌ST型，具體引物長度、退火溫度和PCR產物擴增長度見表1。

表1 肺炎克雷伯菌7對管家基因序列

1.3.2MALDI-TOF MS同源性分析 將保存于-20 ℃冰箱的菌株凍存管中的肺炎克雷伯菌轉種于血瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h后備用。采用甲酸提取法進行菌株處理，用10 μL的一次性接種環(huán)挑取待測菌株于1.5 mL的小型離心管中，加入300 μL的去離子水，取待測菌株至小型離心管中，用移液槍反復吹打，加入900 μL的無水乙醇充分混勻，13 000 r/min離心2 min，用移液槍棄上清液，整個過程不應觸碰沉淀。室溫下干燥沉淀2～3 min，向小型離心管中加入50 μL的70%的甲酸和50 μL的乙腈充分混勻后以13 000 r/min離心2 min，取1 μL的上清液于MALDI靶板上，晾干后再加1 μL的HCCA基質晾干后備用。應用MALDI-TOF MS軟件中的MALDI Biotyper RTC軟件進行數(shù)據(jù)采集。通過MALDI-TOF MS中的flexAnalysis獲取蛋白峰信息采集，通過MALDI Biotyper 3軟件進行聚類分析和主成分分析。

2 結 果

2.1MLST分析結果 分析顯示來自重癥醫(yī)學科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌均為ST11型，來自其他科室的6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌中3株為ST147型，2株為ST340型，1株為ST1724型。

2.2MALDI-TOF MS同源性分析結果 應用分析軟件MALDI Biotyper3 對11株肺炎克雷伯菌進行聚類分析，結果見圖1，聚類分析后發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS將11株肺炎克雷伯菌分為兩大類，來自重癥醫(yī)學科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌被劃分為Ⅰ類，來自其他科室的6株肺炎克雷伯菌被劃分為Ⅱ類。5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌蛋白質譜見圖2，可以看出來自重癥醫(yī)學科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌的蛋白峰大致一樣，并且和肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC10031的某些蛋白峰有明顯差異。主成分三維散點分析見圖3，可以看出11株肺炎克雷伯菌處于兩個平面，其中1～5號為來自重癥醫(yī)學科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌，三維散點圖顯示均處于同一個平面且空間距離較近，來自其他科室的6株肺炎克雷伯菌處于其他平面，結果提示5株來自重癥醫(yī)學科的碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌空間較近，推斷親緣關系較近，可能為同一株來源。

注：1～5號為來自重癥醫(yī)學科的碳青霉烯耐藥的5株肺炎克雷伯菌，6～11號為來自其他科室的碳青霉烯敏感的6株肺炎克雷伯菌。圖1 11株肺炎克雷伯菌MALDI-MOF MS同源性分析圖

注：kpn1～kpn5為5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌，kpn6為肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC10031。圖2 5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌和肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC10031的蛋白質譜圖

注：1～5號為來自重癥醫(yī)學科的碳青霉烯耐藥的5株肺炎克雷伯菌，6～11號為來自其他科室的6株肺炎克雷伯菌，PC1為第一主成分，PC2為第二主成分，PC3為第三主成分，Load1為載荷1，Load2為載荷2，Load3為載荷3。圖3 11株肺炎克雷伯菌的主成分三維散點圖

3 討 論

目前高原地區(qū)應用MALDI-TOF MS技術進行CRE同源性分析的研究報道較少。本研究采用MLST和MALDI-TOF MS技術對待測菌株進行同源性分析。MLST分析結果顯示，5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌均為ST11型，6株碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌中3株為ST147型，2株為ST340型，1株為ST1724型。MALDI-TOF MS將11株肺炎克雷伯菌分為兩大類，其中來自重癥醫(yī)學科的5株為Ⅰ類，來自其他科室的6株為Ⅱ類，兩種方法在同源性分析方面的結果基本一致。來自重癥醫(yī)學科的5株碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌中，其中3株來自不同患者的肺泡灌洗液，1株來自患者所處環(huán)境，1株來自呼吸機，同源性分析將其歸為同一類，提示可能是由于院內消毒不徹底引起的院內暴發(fā)，后期的流行病學調查也提示為院內感染。通過后期詢問臨床得知，3例患者中2例死亡，1例患者病情嚴重家屬放棄治療后自動出院，這也提示在今后的工作中要重視CRE引起的院內交叉感染。

CRE引起的院內感染暴發(fā)在國內外已有很多報道，快速對CRE進行同源性分析是控制CRE院內感控的重要手段。李冬菊等[11]應用MALDI-TOF MS技術對重癥ICU病房的懷疑院內感染暴發(fā)的7株肺炎克雷伯菌進行研究，結果發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF MS技術在同源性分析方面可以和MLST分型相媲美，這也和本研究結果一致。國外有學者通過大量的研究得出MALDI-TOF MS在病原菌同源性分析方面的準確度與MLST相類似[12-14]。但是應用MLST進行同源性分析需要高額費用和特定儀器，以及進行PCR擴增后外送測序，使其只能局限在大型的流行病學研究中心，不適用于醫(yī)院中小范圍及高原地區(qū)進行同源性和流行病學分析。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)在高原地區(qū)MALDI-TOF MS在同源性研究方面和MLST分型結果一致，但徐建民等[15]應用MALDI-TOF MS技術分析95株肺炎克雷伯菌后得出，該方法雖然能比較直觀清晰的分析細菌的同源性，但是其廣泛應用于臨床菌株同源性分析方面還需要更深入的實驗研究。MALDI-TOF MS主要是通過分析細菌蛋白質表達的特征峰，而菌體蛋白表達可能會受到溫度、海拔、培養(yǎng)條件等影響，導致兩種方法在同源性分析方面還有差距。

全國細菌耐藥監(jiān)測網數(shù)據(jù)顯示，我國CRE檢出率逐年呈現(xiàn)上升趨勢，其引起的病死率也在逐年增加[1]。GUDUCUOGLU等[16]對某大學醫(yī)院兩個重癥ICU病房8例患者連續(xù)分離出的9株耐碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的肺炎克雷伯菌進行調查，發(fā)現(xiàn)5例患者平均于12 d內因感染死亡，病死率高達62.5%。CRE引起的感染因治療手段有限，在治療上不僅難治而且病死率高，只能采取隔離和消毒等措施[17-20]。青藏高原地區(qū)處我國西北，經濟和醫(yī)療條件相對落后，一旦發(fā)生院內CRE感染其后果相對嚴重，故對高原地區(qū)疑似發(fā)生院內感染暴發(fā)的CRE快速進行同源性分析，可為院內CRE感控提供數(shù)據(jù)支持。MALDI-TOF MS因其快速、方便、經濟的特點，故在同源性分析方面有一定的潛力，尤其對筆者所在的高原地區(qū)的醫(yī)院有一定的應用推廣價值，但需要在今后的研究中加大菌株數(shù)量及不同菌種之間的比較，從而更好更快地為院內感控工作服務。