王 喆，王 敏，楊順玲，梁 娜，黃 帥

河北省邯鄲市眼科醫(yī)院/河北省邯鄲市第三醫(yī)院眼科，河北邯鄲 056001

白內(nèi)障是由遺傳、免疫等原因引起晶狀體蛋白變性而發(fā)生渾濁的一種眼部疾病，其主要臨床表現(xiàn)為單側(cè)或雙側(cè)晶狀體渾濁、視物不清晰等，中老年人為多發(fā)群體，發(fā)病率隨年齡增大而升高。但白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，研究表明，晶狀體的生長(zhǎng)涉及上皮細(xì)胞的增殖及分化，而細(xì)胞生長(zhǎng)分化受多種信號(hào)因子和機(jī)制的調(diào)節(jié)[1-2]。鈣調(diào)節(jié)蛋白3(CNN3)是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、胚胎發(fā)育、肌細(xì)胞生成和細(xì)胞融合過程中發(fā)揮重要作用[3]。研究表明，CNN3是眼發(fā)育所需要的同源盒蛋白(OTX2)轉(zhuǎn)錄因子的下游靶基因[4]。Yes相關(guān)蛋白(YAP)是Hippo信號(hào)通路相關(guān)因子，在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育凋亡過程中發(fā)揮作用，研究表明，Hippo/YAP通路在調(diào)控晶狀體細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用[5-6]。何章彪等[7]研究表明，在大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)誘導(dǎo)的核YAP表達(dá)在促進(jìn)晶狀體上皮細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，抑制YAP后，可顯著抑制FGF誘導(dǎo)的晶狀體細(xì)胞增殖。但是CNN3、YAP在白內(nèi)障中的確切作用機(jī)制尚不明確。本研究檢測(cè)老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3、YAP信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表達(dá)情況，分析CNN3 mRNA、YAP mRNA表達(dá)水平與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年2月至2021年9月本院收治的老年性白內(nèi)障患者67例作為老年性白內(nèi)障組，所有患者均接受手術(shù)治療，留取晶狀體前囊膜標(biāo)本，其中男37例，女30例；年齡58～76歲，平均(62.80±8.71)歲；病程2～5年，平均(3.50±1.20)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均符合老年性白內(nèi)障診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)最佳矯正視力≥0.5，角膜散光<1.00 D；(3)未患有青光眼、視神經(jīng)炎、眼部發(fā)炎等其他眼部疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患其他類型白內(nèi)障、外傷等眼部疾病者；(2)合并高血壓、糖尿病及其他繼發(fā)性視力減退疾病者；(3)合并認(rèn)知障礙或精神疾病患者。另選取同期于本院進(jìn)行角膜移植術(shù)并排除白內(nèi)障的患者42例為對(duì)照組，其中男25例，女17例；年齡56～75歲，平均(61.90±8.63)歲。老年性白內(nèi)障組和對(duì)照組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑盒(批號(hào)BJK1596)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)BJK1813)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(批號(hào)BJS8023)、兔抗人CNN3(批號(hào)ab204365)、YAP(批號(hào)ab52771)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，批號(hào)ab30157)單克隆抗體、鼠抗人二抗(批號(hào)ab90073)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C1071S)購(gòu)自南京立喬生物科技有限公司；qPCR儀(型號(hào)ProFlex)、蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)(型號(hào)CL1500)、流式細(xì)胞儀(型號(hào)CJ1900)均購(gòu)自深圳市德誠(chéng)儀器科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及保存 收集老年性白內(nèi)障組與對(duì)照組患者的晶狀體前囊膜(晶狀體前囊膜主要由上皮細(xì)胞構(gòu)成)，直徑約6 mm，生理鹽水沖洗后立即置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2qPCR法檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表達(dá) 應(yīng)用Trizol試劑盒提取晶狀體上皮細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qPCR試劑盒合成反應(yīng)體系然后進(jìn)行擴(kuò)增，CNN3 mRNA、YAP mRNA和內(nèi)參基因β-actin引物序列由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s；94 ℃ 60 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，38個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，CNN3 mRNA、YAP mRNA表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值。

表1 引物序列

1.3.3蛋白免疫印跡法檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3、YAP蛋白表達(dá) 在晶狀體上皮細(xì)胞中加入裂解液裂解30 min后，以12 000 r/ min離心30 min，取上清液，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗CNN3、YAP和β-actin(稀釋濃度1∶500)，4 ℃孵化過夜，TBST洗膜3次，再加入鼠抗人二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，使用ECL顯色液顯色，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)各條帶進(jìn)行灰度分析，以相對(duì)灰度值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡 晶狀體上皮細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×105個(gè)，使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)照組和老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA表達(dá)水平升高，YAP mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 對(duì)照組和老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3mRNA、YAP mRNA表達(dá)水平比較

2.2對(duì)照組和老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3、YAP蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3蛋白表達(dá)水平升高，YAP蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖1、表3。

表3 對(duì)照組和老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3、YAP蛋白表達(dá)水平比較

圖1 對(duì)照組和老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中的CNN3、YAP蛋白印跡圖

2.3老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA與YAP mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析 老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA與YAP mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.658，P<0.001)。

2.4對(duì)照組和老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率比較 老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率為(16.72±3.43)%，高于對(duì)照組的(2.98±0.45)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

注：A為對(duì)照組；B為老年性白內(nèi)障組。圖2 對(duì)照組和老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡流式圖

2.5老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表達(dá)水平與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析 老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA表達(dá)水平與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.414，P<0.001)，YAP mRNA表達(dá)水平與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.600，P<0.001)。

3 討 論

白內(nèi)障是由于晶狀體調(diào)節(jié)功能失常而引起的晶狀體混濁，由衰老、物理?yè)p傷、手術(shù)、炎癥及藥物等原因造成，可引起視物困難，給患者生活造成極大不便，白內(nèi)障常發(fā)生于40歲以上人群，發(fā)病率與致盲率均居眼部疾病首位[9-10]。目前手術(shù)是治療白內(nèi)障的唯一有效手段，但術(shù)中及術(shù)后出現(xiàn)的各種并發(fā)癥，給患者生活帶來(lái)較大困難。因此，研究白內(nèi)障發(fā)生機(jī)制，對(duì)白內(nèi)障的診斷和治療具有重要臨床意義[11-12]。

CNN3是肌動(dòng)蛋白結(jié)合分子CNN家族的成員，在平滑肌細(xì)胞及大腦神經(jīng)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，缺乏CNN3的動(dòng)物胚胎表現(xiàn)出發(fā)育中的大腦大量畸形，包括腦電圖，延髓神經(jīng)管的閉合缺陷及腦組織的強(qiáng)烈擴(kuò)張[13-14]。還有研究表明，在細(xì)胞增殖過程中，敲除CNN3可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移減少，在分化過程中，CNN3可通過蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和腺苷酸活化蛋白激酶/mTOR通路抑制老鼠肌肉細(xì)胞的肌原性分化、融合和蛋白合成[15]。以上研究表明，CNN3在細(xì)胞增殖、發(fā)育與分化中起著重要調(diào)控作用，本研究結(jié)果顯示，老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示CNN3的異常表達(dá)可能與老年性白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)。

YAP是Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵下游分子，在多種腫瘤組織中有表達(dá)，Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過YAP來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分化[16-17]。研究表明，YAP在晶狀體上皮細(xì)胞增殖和晶狀體纖維分化過程中起著重要作用[18]。另有研究表明，在FGF誘導(dǎo)的大鼠晶狀體上皮外植體中，晶狀體纖維分化與細(xì)胞質(zhì)磷酸化YAP水平升高，抑制YAP可抑制FGF誘導(dǎo)的晶狀體細(xì)胞增殖和晶狀體纖維分化過程中的消融細(xì)胞伸長(zhǎng)[19]。本研究結(jié)果顯示，老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞YAP mRNA和蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，表明YAP的低表達(dá)可能參與老年性白內(nèi)障疾病的發(fā)生。然而CNN3、YAP在老年性白內(nèi)障中的具體作用機(jī)制尚不清楚。

MADDALA等[4]研究表明，CNN3在調(diào)節(jié)晶狀體上皮表型中發(fā)揮重要作用，并揭示了CNN3缺失可引起細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞黏附、極性的改變和收縮活性的增加，從而導(dǎo)致YAP/轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基序激活和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA與YAP mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示CNN3、YAP可能共同參與調(diào)控老年性白內(nèi)障的發(fā)生。由于外部損傷、年齡老化等因素會(huì)使晶狀體上皮細(xì)胞活性降低，YANG等[20]研究顯示，白內(nèi)障的發(fā)生伴隨晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老年性白內(nèi)障組晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，提示晶狀體上皮細(xì)胞凋亡可能與老年性白內(nèi)障疾病的發(fā)生有關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3 mRNA表達(dá)水平與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)，YAP mRNA表達(dá)水平與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示YAP、CNN3可能通過某種作用機(jī)制調(diào)節(jié)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而參與老年性白內(nèi)障疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中CNN3呈高表達(dá)、YAP呈低表達(dá)，與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡率有關(guān)，CNN3、YAP可能參與老年性白內(nèi)障疾病的發(fā)生。二者在老年性白內(nèi)障疾病中的具體作用機(jī)制尚不清楚，仍需做進(jìn)一步研究。