王 琳，高 潔△，耿 芳

河北省唐山市婦幼保健院：1.病案科；2.檢驗(yàn)科，河北唐山 063000

膿毒癥是一類常見(jiàn)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其主要病理過(guò)程為在感染、創(chuàng)傷等因素作用下體內(nèi)炎癥因子及趨化因子水平升高，導(dǎo)致機(jī)體處于過(guò)度免疫反應(yīng)狀態(tài)，造成機(jī)體在清除病原體過(guò)程中對(duì)自身組織、器官也產(chǎn)生一定損傷[1-3]。流行病學(xué)資料顯示，每年約有1 800萬(wàn)例新發(fā)膿毒癥患者，部分患者甚至進(jìn)展為膿毒癥休克、多器官功能衰竭，嚴(yán)重威脅患者生命健康[4-6]。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活方式的改變，膿毒癥發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給家庭乃至社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[7]。目前，微生物培養(yǎng)為膿毒癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法存在耗時(shí)較長(zhǎng)、準(zhǔn)確率不高等缺點(diǎn)[8]，因此，探討生物學(xué)指標(biāo)用于膿毒癥患兒病情嚴(yán)重程度判斷及預(yù)后評(píng)估，有十分重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，其可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體基因表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)等過(guò)程[9]。miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，miRNA可作為生物標(biāo)志物用于疾病的診斷及預(yù)后評(píng)估[10]。miR-146a可影響機(jī)體炎癥反應(yīng)，已廣泛運(yùn)用于炎癥反應(yīng)疾病的診斷及評(píng)估中[11]。也有研究證實(shí)，miR-223在膿毒癥患者炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]?；诖?，本研究通過(guò)探討膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床上診治膿毒癥患兒提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2021年1月本院收治的93例膿毒癥患兒為膿毒癥組，其中男53例，女40例；平均年齡(1.93±0.34)歲。選取同期于本院進(jìn)行體檢的93例體檢健康兒童為對(duì)照組，其中男57例，女36例；平均年齡(1.95±0.28)歲，兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。膿毒癥患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《膿毒癥與感染性休克的國(guó)際共識(shí)》第三版相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]；(2)重癥監(jiān)護(hù)室住院時(shí)間≥48 h；(3)入院時(shí)急性生理與慢性健康(APACHEⅡ)評(píng)分>12分；(3)臨床資料完整；(4)年齡≤12周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院時(shí)接受抗感染治療者；(2)合并免疫缺陷疾病者；(3)合并其他感染性疾病者；(4)依從性差者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2方法 所有研究對(duì)象于入組時(shí)抽取靜脈血7 mL，分成2管，1管2 mL，1管5 mL，2 mL那管以3 000 r/min離心5 min，分離血清，采用散射比濁法檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平(儀器購(gòu)自深圳普門科技有限公司)，采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)(儀器購(gòu)自北京熱景生物)檢測(cè)降鈣素原(PCT)水平，試劑均購(gòu)自唐山惠康生化免疫試劑有限公司；5 mL那管采用RNA提取試劑盒提取外周全血RNA，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)SYBR實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)試劑盒(購(gòu)自中國(guó)杭州博日科技有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)35次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組miR-146a和miR-223相對(duì)表達(dá)水平，U6為內(nèi)參，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值。引物由中國(guó)北京鼎國(guó)生物科技有限公司合成，miR-146a上游引物序列為5′-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3′，下游引物序列為5′-CCTCGAGTCATTAAAGTGATTTCTCCCAA G-3′；miR-223上游引物序列為5′-GCGCTGTCAGTTTGTCAAATACCC-3′，下游引物序列為5′-CGAATACCTCGGACC-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為見(jiàn)5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

膿毒癥組于入院時(shí)進(jìn)行APACHEⅡ評(píng)分及序貫器官衰竭(SOFA)評(píng)分，并根據(jù)APACHEⅡ評(píng)分將膿毒癥組患兒分為輕度組(42例)、中度組(29例)和重度組(22例)。APACHEⅡ評(píng)分包括急性生理評(píng)分、年齡評(píng)分及慢性健康評(píng)分3方面，分值越高代表患者預(yù)后越差[14]。SOFA評(píng)分主要內(nèi)容為對(duì)患兒以連續(xù)的形式進(jìn)行單個(gè)器官功能評(píng)價(jià)，分值越高代表患兒預(yù)后越差。隨訪28 d根據(jù)膿毒癥患兒存活情況分為存活組(69例)和死亡組(24例)。

1.3觀察指標(biāo) 比較兩組一般資料、CRP、PCT、miR-146a、miR-223水平；比較存活組和死亡組miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平，并采用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在評(píng)估患者預(yù)后中的臨床價(jià)值。比較膿毒癥患兒中輕、中、重度組上述指標(biāo)水平，并采用Pearson相關(guān)分析膿毒癥患兒miR-146a、miR-223水平與CRP、PCT水平及APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1兩組各指標(biāo)水平比較 與對(duì)照組比較，膿毒癥組外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組各指標(biāo)水平比較

2.2不同病情程度膿毒癥患兒各指標(biāo)水平比較 與輕度組比較，中度組和重度組膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)；與中度組比較，重度組膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同病情程度膿毒癥患兒各指標(biāo)水平比較

2.3膿毒癥患兒的miR-146a、miR-223水平與CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分的相關(guān)性分析 膿毒癥患兒的miR-146a、miR-223水平與CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分均呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 膿毒癥患兒的miR-146a、miR-223水平與CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分的相關(guān)性分析

2.4存活組和死亡組miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平比較 與存活組比較，死亡組miR-146a、miR-2233、CRP及PCT水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 存活組和死亡組miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平比較

2.5miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在評(píng)估膿毒癥患兒預(yù)后中的臨床價(jià)值 miR-146a最佳臨界值為4.837，其在評(píng)估患兒預(yù)后的AUC為0.898；miR-223最佳臨界值為12.362，其在評(píng)估患兒預(yù)后的AUC為0.875；CRP最佳臨界值為39.391 mg/L，其評(píng)估患兒預(yù)后的AUC為0.654；PCT最佳臨界值為3.197 ng/mL，其評(píng)估患兒預(yù)后的AUC為0.714，見(jiàn)表5、圖1。

表5 miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在評(píng)估患兒預(yù)后中的臨床價(jià)值

圖1 ROC曲線結(jié)果

3 討 論

膿毒癥的本質(zhì)為機(jī)體對(duì)病原體的免疫反應(yīng)引起過(guò)度炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致自身組織器官的損傷。研究表明，臨床對(duì)膿毒癥的診斷延遲、病情及預(yù)后評(píng)估不準(zhǔn)確將導(dǎo)致膿毒癥患者病死率升高，因此早期治療及對(duì)病情進(jìn)行有效評(píng)估具有十分重要的臨床意義[8]。

膿毒癥患者體內(nèi)會(huì)釋放大量炎癥因子，而這一類炎癥因子可促進(jìn)機(jī)體抵御病原體的侵襲，但當(dāng)炎癥因子水平過(guò)度表達(dá)時(shí)又會(huì)引起免疫反應(yīng)的失衡，導(dǎo)致免疫功能紊亂。目前，臨床上采用部分炎癥因子作為評(píng)估病情的輔助指標(biāo)之一。PCT主要由甲狀腺C細(xì)胞分泌，正常生理?xiàng)l件下，PCT水平極低，而一旦患者發(fā)生感染時(shí)，肝臟巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞在內(nèi)毒素等因素的刺激下，機(jī)體大量分泌PCT，導(dǎo)致血清PCT水平升高，并在感染12～24 h時(shí)達(dá)到峰值[15-16]。CRP是一類急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，具有出現(xiàn)時(shí)間早，水平升高迅速等特點(diǎn)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染性疾病時(shí)，CRP水平將會(huì)出現(xiàn)不同程度的升高。研究表明，CRP作為檢測(cè)機(jī)體炎癥反應(yīng)的敏感性指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，其水平將升高，且水平變化往往不受放化療藥物及激素類藥物的影響[17-18]。本研究結(jié)果顯示，相較于健康兒童，膿毒癥患兒CRP、PCT水平均有所升高。但研究表明，PCT水平升高主要由細(xì)菌性感染或細(xì)菌釋放的內(nèi)毒素和炎癥因子所致，而機(jī)體發(fā)生病毒性感染或在其他因素刺激下往往并不會(huì)引起PCT水平升高，而膿毒癥往往也受病毒感染影響[15]。此外CRP在自身免疫性疾病、燒傷等情況下水平也有所升高，具有特異性較差的缺點(diǎn)[17-18]。因此將PCT或CRP作為膿毒癥的生物標(biāo)志物往往存在各自的缺點(diǎn)，難以獲得較好的效果。筆者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，相較于存活組，死亡組PCT及CRP水平均有所升高，但CRP及PCT水平在評(píng)估患者預(yù)后中的AUC<0.8，且靈敏度及特異度不高。這也進(jìn)一步說(shuō)明CRP及PCT作為膿毒癥的生物標(biāo)志物中存在一定不足。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，可調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡、代謝等生物學(xué)過(guò)程，且其水平異常往往與炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程密切相關(guān)[9]。miR-146a為miRNA家族成員之一，既往研究發(fā)現(xiàn)，在miR-146a與巨噬細(xì)胞極化存在密切聯(lián)系，在巨噬細(xì)胞抵抗病原菌入侵的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，miR-146a呈過(guò)表達(dá)[19]。已有研究證實(shí)，miR-146a可能參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展[20]。侯果等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，相較于健康人群，膿毒癥患者外周血miR-146a水平升高，本研究也得到較為一致的結(jié)論。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著患者病情嚴(yán)重程度的增加，其外周血miR-146a水平也有所升高，且miR-146a水平與CRP、PCT水平及APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分均呈正相關(guān)，這也提示膿毒癥患者miR-146a水平升高，并與患者病情程度及炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)。miR-223為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類位于X染色體上的miRNA，其在骨髓譜系中呈特異性表達(dá)，既往已有研究報(bào)道了miR-223可作為生物標(biāo)志物用于疾病的診斷及病情評(píng)估[22]。還有研究證實(shí)，miR-223與機(jī)體造血功能、免疫反應(yīng)等過(guò)程密切相關(guān)，并可調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)，并提示miR-223可能參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展[23]。本研究結(jié)果顯示，相較于健康兒童，膿毒癥患兒miR-223水平升高，并與患者病情程度及炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)，這也進(jìn)一步證實(shí)miR-223參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。本研究也通過(guò)ROC曲線分析了miR-146a和miR-223在評(píng)估膿毒癥患兒預(yù)后中的臨床價(jià)值，結(jié)果顯示，miR-146a最佳臨界值為4.837，其在評(píng)估患兒預(yù)后中的AUC為0.898；miR-223最佳臨界值為12.362，其在評(píng)估患兒預(yù)后中的AUC為0.875，提示miR-146a和miR-223在評(píng)估膿毒癥患兒預(yù)后中均具有一定的臨床價(jià)值。

綜上所述，膿毒癥患兒miR-146a、miR-223、PCT、CRP水平升高，并與患兒病情嚴(yán)重程度及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，miR-146a、miR-223水平在評(píng)估膿毒癥患兒預(yù)后中均具有一定臨床價(jià)值，但PCT及CRP水平在評(píng)估患兒預(yù)后中的臨床價(jià)值并不顯著。但本研究也存在以下不足：(1)未動(dòng)態(tài)觀察各指標(biāo)變化情況，難以獲得連續(xù)性資料；(2)研究所納入樣本量較少，且樣本來(lái)源為單中心。因此，后續(xù)仍需多中心、大樣本的研究進(jìn)一步加以證實(shí)。