王小全

（黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002）

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus,T2DM）是一種慢性代謝疾病，病理特征為機(jī)體處于高血糖狀態(tài)、機(jī)體相對缺乏胰島素、機(jī)體胰島素抵抗等［1］。非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）為我國最常見慢性肝臟疾病，肝細(xì)胞中脂肪大量沉積為其主要病理特征［2］。T2DM與NAFLD 因有著共同的發(fā)病因素而常并存［3］。調(diào)查［4］顯示，普通成人患病率在20%～30% 之間，T2DM 病人NAFLD 患病率在28%～70% 之間。肥胖狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)單核細(xì)胞促炎表型（M1 型）/抗炎表型（M2 型）失衡，致使多種促炎因子產(chǎn)生，向各組織器官浸潤，引起組織器官損傷，導(dǎo)致胰島素抵抗，最終促進(jìn)T2DM 與NAFLD 發(fā)病及進(jìn)展［5］。因此，研究T2DM 伴NAFLD 與M1/M2 失衡的關(guān)系對于該病的臨床診治有著重要意義。人新飽食分子蛋白-1（nesfatin-1）是一種對機(jī)體攝食、能量代謝有著調(diào)節(jié)作用的脂肪細(xì)胞因子，脂肪分化相關(guān)蛋白（adipophilin,ADRP）是一種能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的脂滴表面蛋白，兩種蛋白均與T2DM 伴NAFLD 有關(guān)［6-7］，但尚無研究報道其與患者M(jìn)1/M2 失衡的關(guān)系。因此，本研究分析了老年T2DM 伴NAFLD 患者nesfatin-1、ADRP 水平與外周單核細(xì)胞M1/M2 失衡的關(guān)系，旨在探索T2DM伴NAFLD 的發(fā)病機(jī)制，為以后治療尋找新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20180123）。選擇2019 年2 月至2021 年2 月黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院收治的143 例T2DM 患者，根據(jù)是否發(fā)生NAFLD 分為非NAFLD 組（n=79）和NAFLD 組（n=64）。非NAFLD 組：年齡60～85 歲，平均（71.00±5.62）歲；男51 例，女28 例；體質(zhì)量指數(shù)（24.79±2.53）kg/m2；糖尿病病程2～8 年，平均（5.23±1.88）年。NAFLD 組：年 齡60～82 歲，平 均（72.26±5.39）歲；男40 例，女24 例；體質(zhì)量指數(shù)（23.00±2.17）kg/m2；糖尿病病程1～9 年，平均（5.67±1.76）年。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①T2DM 診斷充分符合1999 年世界衛(wèi)生組織（WHO）標(biāo)準(zhǔn)［8］；②NAFLD 診斷充分符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018 年更新版）》［9］；③年齡≥60 歲；④無凝血系統(tǒng)疾病或炎癥性腸??；⑤近期無創(chuàng)傷或手術(shù)等應(yīng)激情況；⑥簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他肝病，如藥物性肝病、病毒性肝病、自身免疫性肝病等；②合并各種急性或慢性感染、甲狀腺功能疾病、精神病、腦血管意外、腎功能不良、心電圖異常、結(jié)締組織病、惡性腫瘤；③病歷資料不全；④入院前接受與T2DM 伴NAFLD 有關(guān)的治療；⑤正在參與其他臨床試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集及血清nesfatin-1、ADRP 水平測定 入院后記錄年齡、性別，測量所有受試者身高和體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)，采用韓國AMP 自動電子血壓計BP-705（上海聚慕醫(yī)療器械有限公司）測定收縮壓、舒張壓。所有受試者空腹10 h 以上，次日早晨抽取5 mL 靜脈血，采用Thermo Fisher Multiskan GO 全波長酶標(biāo)儀（北京賽百奧科技有限公司）、nesfatin-1 試劑盒（上海心語生物科技有限公司，批號SRE-11481）、ADRP 試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號YS01785B）檢測nesfatin-1、ADRP 水平，采用全自動糖化血紅蛋白分析儀（日本TOSOH 公司）、相應(yīng)試劑盒（上海富雨生物科技有限公司，批號FY-03999H1）檢測糖化血紅蛋白水平，采用PUZS-300 全自動生化分析儀（廣州市艾貝泰生物科技有限公司）、相應(yīng)試劑盒（上海一研生物科技有限公司，批號EY-H97046）檢測血肌酐水平。操作步驟嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 外周血單核細(xì)胞M1/M2 相關(guān)細(xì)胞因子mRNA 水平測定 取所有受試者外周靜脈血5 mL，用肝素鈉抗凝后經(jīng)FicollPaque 梯度分離法將外周單核細(xì)胞分離出來，據(jù)TRIzol 試劑盒（武漢純度生物科技有限公司，批號CD-13433-ML）說明書對總RNA 進(jìn)行提取，據(jù)SuperscriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（北京伊塔生物科技有限公司，批號YT9036）說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-PCR）法［10］對腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6,IL-6）、白細(xì)胞介素10（interleukin 10,IL-10）mRNA 水平進(jìn)行檢測，在Bio-Rad 伯樂PCR 儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）上行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：預(yù)變性（95℃、30 s），變性（95℃、5 s），退火延伸（60℃、34 s），40 個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，據(jù)擴(kuò)增曲線讀取循環(huán)閾值（Ct），以U6 為內(nèi)參基因，通過相對定量法以2-△△Ct對TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA 水平進(jìn)行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，如年齡、nesfatin-1、ADRP、體質(zhì)量指數(shù)、血肌酐、糖化血紅蛋白、收縮壓、舒張壓等，組間比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以百分率（%）表示，如性別等，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 檢驗(yàn)分析nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細(xì)胞M1/M2 相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系；采用Logistic回歸分析T2DM 患者nesfatin-1、ADRP 水平與非酒精性脂肪肝病患病風(fēng)險的關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料及血清nesfatin-1、ADRP 水平比較

與非NAFLD 組比較，NAFLD 組血清nesfatin-1、ADRP 水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血肌酐、糖化血紅蛋白、收縮壓、舒張壓比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料及血清nesfatin-1、ADRP 水平

2.2 兩組外周血單核細(xì)胞M1/M2 相關(guān)細(xì)胞因子mRNA 水平

與非NAFLD 組比較，NAFLD 組TNF-α、IL-6 mRNA 水平增高（P＜0.05），IL-10 mRNA 水平減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組外周血單核細(xì)胞M1/M2 相關(guān)細(xì)胞因子mRNA 水平（）

表2 兩組外周血單核細(xì)胞M1/M2 相關(guān)細(xì)胞因子mRNA 水平（）

2.3 Pearson 相關(guān)性分析

Nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA 水平呈正相關(guān)（P＜0.05），nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細(xì)胞IL-10 mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細(xì)胞M1/M2 相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系

2.4 Logistic 回歸分析

以T2DM 伴非酒精性脂肪肝病為因變量，以年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血肌酐、糖化血紅蛋白、收縮壓、舒張壓、nesfatin-1、ADRP 為自變量，進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果得出年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、血肌酐、糖化血紅蛋白、收縮壓、舒張壓與T2DM 伴非酒精性脂肪肝病無顯著關(guān)聯(lián)（P＞0.05），而血清nesfatin-1 高水平、血清ADRP 高水平是T2DM 伴NAFLD 的危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 T2DM 患者nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 患病風(fēng)險的Logistic 回歸分析結(jié)果

3 討論

Nesfatin-1 為脂肪細(xì)胞因子之一，由82 個氨基酸組成，最初發(fā)現(xiàn)于下丘腦及腦干中，有減輕體質(zhì)量和抑制攝食及降低血糖水平作用［11-13］。有基礎(chǔ)研究［14］發(fā)現(xiàn)，向大鼠腦室內(nèi)注射nesfatin-1 后，其攝食變少，體質(zhì)量降低，反之，腦室注射nesfatin-1 抗體之后大鼠的食欲顯著增加。另有研究［15］顯示，靜脈注射nesfatin-1 能夠持續(xù)性地降低高血糖小鼠的血糖水平長達(dá)6 h，進(jìn)一步推測nesfatin-1 可能與機(jī)體糖脂代謝及胰島素抵抗關(guān)系密切。報道［16］提示，中樞nesfatin-1 可以通過活化InsR/IRS-1/AMPK/Akt/mTOR/TORc2 通路而改善肥胖動物模型小鼠的肝胰島素敏感性。某小樣本研究［17］顯示，2 型糖尿病患者循環(huán)血內(nèi)nesfatin-1遠(yuǎn)高于正常人，血清nesfatin-1 可能與2 型糖尿病的發(fā)生有關(guān)，并與患者胰島素抵抗有一定關(guān)系。本次研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 組血清nesfatin-1 水平較非NAFLD 組增高，通過Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)血清nesfatin-1 高水平（O^R=3.325,95%CI=1.481～11.811）是T2DM 伴非酒精性脂肪肝病的危險因素，說明nesfatin-1 在T2DM 伴非酒精性脂肪肝病的發(fā)生中具有一定作用。

ADRP 為一種脂滴表面蛋白，由425 個氨基酸組成，50 kDa 為其分子量，分布于脂滴表面，在不同細(xì)胞中有廣泛表達(dá)，如肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞等。該蛋白能夠增加胰島細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚，和胰島素抵抗、胰島素異常分泌、肝臟脂質(zhì)代謝有關(guān)，是脂質(zhì)積聚標(biāo)志之一［18］。研究［19］顯示，缺氧可影響機(jī)體脂質(zhì)代謝狀況，缺氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α）可通過上調(diào)ADRP 表達(dá)而促進(jìn)膽固醇和脂肪酸攝取增加。資料［20］顯示，ADRP 可通過調(diào)節(jié)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白水平而參與體內(nèi)脂肪從頭合成途徑。有學(xué)者進(jìn)行肝組織活檢發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝病患者肝臟ADRP 表達(dá)水平比正常人肝臟要高［21］。本研究結(jié)果與上述報道一致，即本次研究顯示ADRP 在伴NAFLD 的T2DM 患者中呈高表達(dá)水平，且ADRP 高水平是T2DM 伴非酒精性脂肪肝病的危險因素，進(jìn)一步分析，ADRP 表達(dá)上調(diào)可能使肝細(xì)胞脂質(zhì)過度積聚，從而參與T2DM 患者NAFLD 的形成。

單核細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞，由外周血循環(huán)系統(tǒng)中的骨髓髓系前體細(xì)胞分化而來，外周血單核細(xì)胞能夠一定程度地反映機(jī)體炎癥狀態(tài)。機(jī)體處于肥胖狀態(tài)下時，外周血單核細(xì)胞數(shù)量大量增加，單核細(xì)胞M1 促炎表型增高（如TNF-α、IL-6 水平上調(diào)），M2 抗炎表型減弱（如IL-10 水平下調(diào)），導(dǎo)致M1/M2 比例失衡，誘發(fā)機(jī)體組織器官出現(xiàn)損傷，引發(fā)機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗，從而加重糖尿病病情及促使其并發(fā)癥的發(fā)生［22］。本次研究發(fā)現(xiàn)，與非NAFLD 組比較，NAFLD 組TNF-α、IL-6 mRNA 水平增高，IL-10 mRNA 水平減少，可能是因?yàn)門2DM 伴NAFLD 患者體內(nèi)高糖和高脂水平造成單核細(xì)胞M1/M2 失衡，從而表現(xiàn)為促炎和抗炎因子水平異常變化。本次Pearson 檢驗(yàn)分析顯示，nesfatin-1、ADRP 水平與NAFLD 組患者外周單核細(xì)胞TNF-α、IL-6 mRNA 水平呈正相關(guān)，而與IL-10 mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)，提示nesfatin-1、ADRP與T2DM 伴NAFLD 患者外周單核細(xì)胞M1/M2 失衡關(guān)系密切，即與患者體內(nèi)慢性低度炎癥狀態(tài)相關(guān)，有望將nesfatin-1 和ADRP 作為T2DM 伴NAFLD患者抗炎治療干預(yù)的新靶點(diǎn)。

綜上所述，高水平nesfatin-1、ADRP 是T2DM伴非酒精性脂肪肝病的危險因素，其表達(dá)水平與外周單核細(xì)胞M1/M2 失衡有著密切相關(guān)性，有望將nesfatin-1 和ADRP 作為患者抗炎治療干預(yù)的新靶點(diǎn)。但其機(jī)制不明，有待進(jìn)一步探索。