王嘉歡，陳曉杰，張福彥，范家霖，楊保安，程仲杰，張建偉

（河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司/河南省核農(nóng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450015）

表皮蠟質(zhì)是陸生植物地上部分的第一道物理屏障，在植物與環(huán)境的相互作用過(guò)程中，應(yīng)對(duì)各種多變的環(huán)境脅迫時(shí)扮演著重要的角色［1］.表皮蠟質(zhì)可以保護(hù)植物免受強(qiáng)紫外線輻射和高溫的危害［2］，增加植物對(duì)高鹽和低溫的耐受性，還可以抵御外界病蟲(chóng)害和食草動(dòng)物的侵害［3-5］，限制植物的非氣孔水分流失［6-7］，另外，表皮蠟質(zhì)還與植物抗旱性及產(chǎn)量密切正相關(guān)［2，8-10］.不同植物表皮中的蠟質(zhì)成分是不同，例如在番茄的葉片和果實(shí)中，蠟質(zhì)主要成分為直連烷烴、支鏈烷烴、脂肪醇和三萜類(lèi)等化合物［11］，而荷葉表皮中蠟質(zhì)成分重要為長(zhǎng)鏈直鏈二醇、長(zhǎng)鏈次級(jí)醇、伯醇以及脂肪酸等化合物［12］.禾本科植物表皮蠟質(zhì)化學(xué)組成主要有烷烴類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、萜類(lèi)及其他一些未知成分［13］.

小麥（Triticum aestivumL.）是在全球溫帶地區(qū)種植的最重要的糧食作物之一.小麥蠟質(zhì)是指覆蓋在小麥表皮細(xì)胞外的一層由親脂性化合物構(gòu)成的疏水層，小麥的葉、莖、穗和芒等部位表面均被蠟質(zhì)層覆蓋，其表皮有大量的蠟質(zhì).小麥蠟質(zhì)主要成分是超長(zhǎng)鏈脂肪酸及其衍生物，包括初級(jí)醇、烷烴、醛、脂肪酸、β-和OH-β-二酮［14-16］.蠟質(zhì)組分在小麥不同器官是不同的，小麥葉片表皮蠟質(zhì)主要組分是初級(jí)醇，葉鞘和莖表皮蠟質(zhì)主要組分是β-二酮［17-18］.β-二酮主要為正三十一烷-14、16-二酮，由于β-二酮的存在，許多現(xiàn)代小麥品種表現(xiàn)出白霜狀蠟質(zhì)外觀.

雖然有關(guān)小麥表皮蠟質(zhì)組成的研究已經(jīng)較多，但大多數(shù)研究關(guān)注于小麥的葉片，對(duì)穗部的研究較少.小麥穗部作為重要的光合器官，對(duì)產(chǎn)量有直接貢獻(xiàn)，目前尚不清楚不同品種小麥穗部表皮蠟質(zhì)組成的差異.因此，為了了解小麥穗部表皮蠟質(zhì)的組成特點(diǎn)，并獲得小麥穗部表皮蠟質(zhì)的含量及成分?jǐn)?shù)據(jù)，本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)四種不同現(xiàn)代品種小麥材料的穗部表皮蠟質(zhì)進(jìn)行測(cè)定和分析，獲得小麥蠟質(zhì)組成成分特征和品種間差異，為后續(xù)研究小麥蠟質(zhì)分子機(jī)理提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯仿（英豐，中國(guó)）、正二十四烷烴、吡啶和雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）均購(gòu)自美國(guó)的西格瑪奧德里奇公司.主要儀器有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890B，安捷倫，美國(guó)）、氣相色譜樣品瓶（安捷倫，美國(guó)）、容量瓶（天玻，中國(guó)），千分之一分析天平（BSA224S，賽多利斯，德國(guó)）、恒溫水浴鍋（DZKW-C，樹(shù)立，中國(guó)）、氮吹儀（LC-DCY-12G，力辰，中國(guó)）、烘干箱（DHG-9246A，精宏，中國(guó)）.

1.2 試驗(yàn)材料

洛旱17、鄭品麥22號(hào)、中育1331、齊民7號(hào)四個(gè)小麥品種，于2020年10月15日種植于鄭州市新鄭市新村鎮(zhèn)小麥試驗(yàn)基地（34°39′N(xiāo) 113°74′E）.每個(gè)品種的小麥以10 cm的間距人工點(diǎn)播種植在行長(zhǎng)為1.5 m、行距25 cm的試驗(yàn)田中.2021年4月20日選取樣品，用干凈的剪刀選取揚(yáng)花期的小麥穗部，然后保存于4℃冰箱中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品配制

用千分之一分析天平準(zhǔn)確稱取0.05 g正二十四烷烴（C24）標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，加入50 mL氯仿溶液配制成質(zhì)量濃度為1 μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)品液，密封后置于4℃冰箱保存.

1.4 氯仿浸提法提取小麥穗部表皮蠟質(zhì)

將新鮮干凈的小麥穗子放于提前用氯仿潤(rùn)洗過(guò)的小燒杯中，加入25～35 mL氯仿，使組織完全浸沒(méi)在氯仿中，然后加入20 μL正二十四烷烴（C24，1 μg/μL）作為內(nèi)標(biāo)，輕輕晃動(dòng)燒杯，浸提60 s.浸提完后，用干凈的鑷子撈出組織，將提取后的組織放入烘箱中烘干24 h后測(cè)定其干重，將浸提液放置于通風(fēng)櫥中使其揮發(fā)變少.將揮發(fā)后的提取液（10 mL）通過(guò)濾紙過(guò)濾到小玻璃瓶中，然后置于通風(fēng)櫥中完全揮發(fā).加入1 mL的氯仿于小玻璃瓶中，然后轉(zhuǎn)入氣相色譜樣品瓶中，置于通風(fēng)櫥中使其完全揮發(fā).

1.5 蠟質(zhì)提取物的衍生化反應(yīng)

為了使提取到的蠟質(zhì)能被氣相色譜（Gas chromatography，GC）充分檢測(cè)到，需先進(jìn)行衍生反應(yīng).衍生反應(yīng)的目的是將含有羥基（OH-）的化合物轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的三甲基甲硅烷基衍生物［19］.具體步驟是：將樣品在氮?dú)庀赂稍?，然后加?0 μL的BSTFA和40 μL吡啶，將GC小瓶蓋好蓋子，并將混合物置于70℃金屬浴中60 min，然后迅速在氮?dú)庀麓蹈煞磻?yīng)物，最后加入800 μL的氯仿用于下一步GC的測(cè)定.

1.6 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析蠟質(zhì)成分

配備有質(zhì)譜檢測(cè)器（Mass spectrometer，MS）和火焰離子化檢測(cè)器（Flame ionization detector，F(xiàn)ID）的GC分別用于組合物定性和定量分析.小麥蠟質(zhì)提取物的成分在毛細(xì)管柱HP-1（長(zhǎng)度30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚度0.25 μm；安捷倫，美國(guó)）上進(jìn)行分析，并連接至FID，載氣位氮?dú)?，進(jìn)樣體積1 μL，SPL1氣化室溫度為305℃、檢測(cè)器溫度為310℃、色譜柱流量為2 mL/min.溫度程序如下：在50℃下保持2 min；然后以20℃/min的速度升溫至220℃，保持2 min；接著以4℃/min的速度升溫至310℃，然后在310℃保持5 min.

在與上述相同的GC條件下使用GC-MS對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，但調(diào)節(jié)載氣為氦氣，氦氣的流速為2.00 mL/min.掃描模式為全掃描模式，掃描的范圍為35～700 m/z.

1.7 數(shù)據(jù)分析

基于每種化合物的峰面積和C24的峰面積計(jì)算每種蠟質(zhì)組分的含量.所有小麥樣品一式三份進(jìn)行分析，每三個(gè)樣品的方差系數(shù)（C.V.）小于15%.采用SIGMA PLOT 14.0作圖后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥蠟質(zhì)表型分析

通過(guò)觀察四個(gè)品種小麥揚(yáng)花期的穗部蠟質(zhì)表型（圖1），發(fā)現(xiàn)洛旱17表型為淡綠色，鄭品麥22、中育1331和齊民7號(hào)的表型都有不同程度的白霜狀蠟質(zhì)覆蓋，其中鄭品麥22白霜狀較少，中育1331次之，齊民7號(hào)的白霜狀蠟質(zhì)層最厚.這些表型說(shuō)明，不同品種的小麥穗部表皮蠟質(zhì)存在差異，需進(jìn)一步進(jìn)行成分鑒定.

圖1 四個(gè)小麥品種蠟質(zhì)表型Fig.1 Cuticular wax phenotypes of four wheat varieties

2.2 小麥蠟質(zhì)成分鑒定

洛旱17、鄭品麥22、中育1331、齊民7號(hào)氣相色譜圖見(jiàn)圖2，通過(guò)GC-MS得到其離子峰，并借助質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)檢索來(lái)鑒定各個(gè)蠟質(zhì)的組分［15］.四個(gè)小麥品種中均檢測(cè)出了不同的蠟質(zhì)成分，每一個(gè)品種小麥（除洛旱17外）表皮蠟質(zhì)提取物中均鑒定出了16種成分（圖2）.洛旱17表皮蠟質(zhì)提取物中鑒定到了15種化學(xué)成分，比其他三個(gè)品種的蠟質(zhì)少一種，即31-OH-β-二酮.鑒定到的這些成分包括四大類(lèi)：烷烴、初級(jí)醇、脂肪醛和二酮.這四大類(lèi)化學(xué)成分各由不同長(zhǎng)度碳鏈組成，其中烷烴均由奇數(shù)碳鏈組成，碳鏈長(zhǎng)度為25～33；初級(jí)醇均由偶數(shù)碳鏈組成，碳鏈長(zhǎng)度22～30；脂肪醛均由偶數(shù)碳鏈組成，碳鏈長(zhǎng)度24～28；而二酮?jiǎng)t由單一碳鏈組成，碳鏈長(zhǎng)度為31，由31-β-二酮和31-OH-β-二酮組成.通過(guò)氣相色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，不同的品種間的蠟質(zhì)組分存在差異.

圖2 四個(gè)小麥品種蠟質(zhì)氣相色譜圖Fig.2 GC chromatograms of cuticular wax of four wheat varieties

2.3 小麥蠟質(zhì)各組分同系物含量分析

通過(guò)進(jìn)一步定量分析，發(fā)現(xiàn)四個(gè)小麥品種的蠟質(zhì)各組分同系物絕對(duì)含量w之間存在較大差異.在洛旱17的穗部各蠟質(zhì)組分中，烷烴由5種不同鏈長(zhǎng)組成，其中二十九烷烴占主導(dǎo)地位，w=（70.7±0.9）μg/g，二十七烷烴次之，三十一烷烴和二十五烷烴含量相當(dāng)，三十三烷烴最低.初級(jí)醇的各組分也存在差異，其中二十六醇含量最高，w=（177.0±14.8）μg/g，二十八醇、二十四醇和三十醇含量較低，而二十二醇最低.脂肪醛的各組分差異較小，與其他組分相比含量較低，其中二十八醛含量最高，w僅為（14.0±0.7）μg/g，二十四醛、二十八醛以及三十醛的含量較低.另外，比較特殊的是在洛旱17的表皮蠟質(zhì)中，僅檢測(cè)到了31-β-二酮，w=（135.9±14.0）μg/g，而未檢測(cè)到OH-β-二酮，其他的三個(gè)小麥材料中則同時(shí)檢測(cè)到了β-二酮和OH-β-二酮（圖3）.從總體組分上來(lái)看，洛旱17表皮蠟質(zhì)中二十六醇含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，β-二酮含量次之，隨后是二十九烷烴，而脂肪醛的各組分含量均較少.

圖3 四個(gè)小麥品種蠟質(zhì)各組分含量Fig.3 Content of individual wax constituent of four wheat varieties

鄭品麥22和中育1331穗部的各蠟質(zhì)組分的分布規(guī)律接近且不同于洛旱17，在這兩個(gè)品種的初級(jí)醇組分中，二十四醇的含量均占主導(dǎo)地位，w分別達(dá)到了（23.4±1.9）μg/g和（67.3±5.6）μg/g，三十醇的含量次之，其他鏈長(zhǎng)的初級(jí)醇含量都較低.在脂肪醛的各組分中，三十醛的含量最高，w分別為（11.2±0.2）μg/g和（18.5±1.6）μg/g，二十六醛次之，其他醛的含量都很低.在二酮的各組分中，這兩個(gè)品種的β-二酮的含量較高且較為接近，w分別為（35.4±1.5）μg/g和（36.8±2.5）μg/g，而OH-β-二酮的含量較低，w分別為（18.4±0.8）μg/g和（32.5±1.7）μg/g.值得注意的是，中育1331表皮蠟質(zhì)中的OH-β-二酮的含量是鄭品麥22的1.8倍.另外，稍有不同的是，鄭品麥22和中育1331表皮蠟質(zhì)中的烷烴分布不一樣，在鄭品麥22的穗部表皮蠟質(zhì)中，三十一烷烴含量最高，w=（144.1±9.0）μg/g，二十九烷烴次之，其他鏈長(zhǎng)的烷烴含量較低，其中二十五烷烴含量最低；而在中育1331中，二十九烷烴含量最高，w=（130.8±6.6）μg/g，三十一烷烴次之，其他鏈長(zhǎng)的烷烴含量較低，二十五烷烴含量最低.從總體組分上來(lái)看，鄭品麥22和中育1331表皮蠟質(zhì)中二十九烷烴或三十一烷烴含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，31-β-二酮或二十四醇的含量次之，而脂肪醛的各組分含量均較少.

齊民7號(hào)的穗部表皮蠟質(zhì)中的烷烴各組分分布與鄭品麥22類(lèi)似，都是三十一烷烴含量最高，二十九烷烴次之，二十五烷烴含量最低.齊民7號(hào)表皮蠟質(zhì)中的初級(jí)醇的各組分則與其他三個(gè)材料的分布都不同，其中二十六醇含量最高，二十二醇和三十醇含量次之，而二十四醇含量最低；同樣的，在脂肪醛的各組分含量均比較低，其中二十八醛含量最高，二十六醛含量最低.齊民7號(hào)與其他材料明顯不一樣的地方是蠟質(zhì)組分中有大量的二酮，其中w（31-β-二酮）高達(dá)（375.7±24.7）μg/g，是其他三個(gè)材料的2.8～10.6倍；w（31-OH-β-二酮）也很高，達(dá)到了（116.7±15.3）μg/g，分別是鄭品麥22號(hào)和中育1331的6.4倍和3.6倍.從總體組分上來(lái)看，齊民7號(hào)的表皮蠟質(zhì)中β-二酮和OH-β-二酮含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，二十六醇的含量次之，而脂肪醛的各組分含量均較少.

2.4 小麥蠟質(zhì)各組分總量分析

通過(guò)分析四個(gè)品種小麥穗部蠟質(zhì)各組分同系物含量得到了各組分總量及相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 四個(gè)小麥品種表皮蠟質(zhì)各組分的絕對(duì)含量和相對(duì)含量Tab.1 Absolute and relative contents of individual wax constituent of four wheat varieties

結(jié)果顯示，齊民7號(hào)的蠟質(zhì)總量最高，為（1 021.2±55.3）μg/g，洛旱17和中育1331的蠟質(zhì)總量較為接近，而鄭品麥22的蠟質(zhì)總量最低，為（431.1±20.2）μg/g.在這四個(gè)品種穗部表皮蠟質(zhì)中，脂肪醛的總量均比較低，相對(duì)含量范圍為4.4%～8.0%，而其他組分含量則差異較大.雖然洛旱17和中育1331的蠟質(zhì)總量接近，但是兩個(gè)品種各組分總量差異很大，洛旱17的初級(jí)醇絕對(duì)含量最高，達(dá)到了（218.7±15）μg/g（相對(duì)含量為38.5%），且比其他三個(gè)材料初級(jí)醇的含量都高；而中育1331則是烷烴總量最高，相對(duì)含量達(dá)到59.7%，初級(jí)醇絕對(duì)含量較低，為（107.3±6.5）μg/g.鄭品麥22中烷烴占主導(dǎo)地位，相對(duì)含量達(dá)到了72.1%.而在齊民7號(hào)中，二酮絕對(duì)含量最高，為（492.4±40）μg/g，相對(duì)含量達(dá)到了48.2%.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同品種的小麥穗部表皮蠟質(zhì)組分及含量是不同的，即便表皮蠟質(zhì)總量接近，各組分也存在差異.另外，先前的研究往往認(rèn)為有白霜狀表型的材料為高蠟質(zhì)材料，有淡綠色表型的材料為低蠟質(zhì)材料.而本研究發(fā)現(xiàn)，淡綠色表型的洛旱17蠟質(zhì)總量并不是最低的，它的表皮蠟質(zhì)中沒(méi)有OH-β-二酮.白霜狀表型的鄭品麥22、中育1331、齊民7號(hào)的OH-β-二酮含量則依次增高，這與小麥的蠟質(zhì)表型也有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系.因此，可以根據(jù)小麥?zhǔn)欠裼邪姿獱畋硇蛠?lái)確定小麥?zhǔn)欠窈蠴H-β-二酮，而不能根據(jù)表型簡(jiǎn)單的定義低蠟和高蠟材料.由此也可以推斷OH-β-二酮是導(dǎo)致小麥呈現(xiàn)白霜狀表型的主要化合物.

雖然在越來(lái)越多的禾本科植物中發(fā)現(xiàn)了β-二酮和OH-β-二酮［19-21］，關(guān)于二酮基因的定位及分子機(jī)制的研究也越來(lái)越多［22-24］，但是仍舊缺乏對(duì)其生物活性及其潛在機(jī)制的更廣泛理解.因此，基于上述討論，本文章的4個(gè)不同品種的小麥材料可以作為用于進(jìn)一步研究β-二酮和OH-β-二酮生物合成的合適材料，未來(lái)的研究需要更多的生理和基因功能實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步闡明二酮合成的機(jī)理.