劉艷平，朱山，王曾，曾慶真

（1.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東菏澤 274000； 2.菏澤經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)綜合監(jiān)管部，山東菏澤 274000）

小活絡(luò)丸收載于《中華人民共和國藥典》2020年版一部，是由膽南星、制川烏、制草烏、地龍、乳香（制）、沒藥（制）六味中藥粉碎成細(xì)粉，再按照一定比例加煉蜜制成小蜜丸或大蜜丸，具有祛風(fēng)散寒、化痰除濕、活血止痛的作用，用于風(fēng)寒濕邪閉阻、痰疼阻絡(luò)所致的痹病，癥見肢體關(guān)節(jié)疼痛，或冷痛，或刺痛，或疼痛夜甚、關(guān)節(jié)屈伸不利，麻木拘攣［1］。由于療效確切，價(jià)格低廉，深受患者的歡迎。

蜂蜜既為輔料又是一種中藥，為蜜蜂科昆蟲中華蜜蜂或意大利蜂所釀，一般春至秋季采收。其性甘味平，具有補(bǔ)中、潤燥、止痛、解毒等功效；外用生肌斂瘡，用于脘腹虛痛，肺燥干咳，腸燥便秘，解烏頭類藥毒［19］。蜂蜜含有大量的還原糖，在中藥炮制、制劑中作為液體輔料用作賦形劑、黏合劑、矯味劑，能防止藥材中易氧化的成分變質(zhì)，且粘合力強(qiáng)，與藥粉混合后丸劑表面不易硬化，有較大的可塑性，制成的丸粒光潔，滋潤，作用持久，是一種良好的粘合劑［20］，且能增強(qiáng)藥效、緩和藥性。

煉蜜在小活絡(luò)丸中既作為黏合劑，又可降低制川烏、制草烏的毒性［1］。因小活絡(luò)丸價(jià)格低廉，有不法企業(yè)有可能為了降低成本，使用劣質(zhì)蜂蜜或直接摻入蔗糖、果糖、飴糖、果葡糖等代替蜂蜜［2-3］，而蜂蜜的質(zhì)量優(yōu)劣，直接影響小活絡(luò)丸本身療效。因此測定小活絡(luò)丸中蔗糖、果糖、飴糖、果葡糖漿的含量，可以輔助判斷所用輔料蜂蜜的相對優(yōu)劣［4］，同時(shí)可監(jiān)測小活絡(luò)丸的質(zhì)量與療效。

按照《中國藥典》2020年版一部，蜂蜜品種項(xiàng)下蔗糖、麥芽分別不得超過5.0%，果糖和葡萄糖總量不得少于60.0%，果糖與葡萄糖含量比值不得小于1.0。小活絡(luò)丸制法規(guī)定，每100 g藥粉加煉蜜120～130 g，根據(jù)上述檢驗(yàn)結(jié)果與小活絡(luò)丸制法，擬定果糖與葡萄糖總量不少于30%，果糖與葡萄糖含量比值不得低于1.0；蔗糖、麥芽糖分別不得過2.5%［5-7］。

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖常用的測定方法有高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法、高效液相色譜-示差折光檢測（HPLC-RID）法、高效液相色譜-電霧式檢測器（HPLC-CAD）法、超高效合相色譜-質(zhì)譜（UPC2-MS）法、拉曼光譜法、近紅外光譜法、高效液相色譜-熒光檢測法等。HPLC-RID法由于操作簡單、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用［8-18］。目前，小活絡(luò)丸（大蜜丸）中輔料蜂蜜含量的測定方法尚未見報(bào)道。筆者通過高效液相色譜法測定小活絡(luò)丸中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖含量，以判定輔料蜂蜜的添加量，方法簡便，穩(wěn)定可靠，可以為提高小活絡(luò)丸的質(zhì)量和安全提供重要保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，美國安捷倫科技公司。

電子天平：XS205型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

超聲波清洗器：KQ3200E型，昆山市超聲儀器有限公司。

乙腈：色譜純，德國默克公司。

去離子水：Milli-Q Integral純水系統(tǒng)制備。

D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品：批號分別為111504-201703、110833-201908、11507-201704、100287-201905，含量分別為99.8%、99.9%、99.8%、93.7%，均來自中國食品藥品檢定研究院。

膽南星：飲片，批號為190806，四川百勝藥業(yè)有限公司。

制川烏：飲片，批號為191224002，亳州市貢藥飲片廠。

制草烏：飲片，批號為190408，內(nèi)蒙古普康藥業(yè)有限公司。

地龍：飲片，批號為210214160，山東菏澤藍(lán)澤中藥飲片廠。

乳香（制）：飲片，批號為201018 ，亳州市永剛飲片廠有限公司。

沒藥（制）：飲片，批號為210309，亳州市永剛飲片廠有限公司。

小活絡(luò)丸：編號為S1、S2、S3，市售。

1.2 溶液制備

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：取D-無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品500 mg，精密稱定，分別置于25 mL容量瓶中，加50%乙腈-水溶解稀釋至標(biāo)線，搖勻，制備成質(zhì)量濃度均為20 mg/mL的4種糖類混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密量取D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖、麥芽糖混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.25、0.5、1、3、5 mL置于10 mL容量瓶中，加50%乙腈-水溶解稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制成4種糖類質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、6、10 mg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

樣品溶液：將小活絡(luò)丸樣品剪碎，取1 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，精密加入25 mL 50%乙腈-水，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用50%乙腈-水補(bǔ)足減失的重量，混勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

陰性樣品溶液：按處方比例（每100 g藥粉加煉蜜120～130 g）及工藝，制備不添加煉蜜的陰性樣品，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備相應(yīng)的溶液，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Carbohydrate型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技公司），柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水（體積比為75∶25）；流量：1 mL/min；檢測器：示差折光檢測器；溫度：40 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.4 超聲方法

結(jié)果顯示在用50%乙腈-水作提取溶劑，水超聲45 min，

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶液的選擇

參考文獻(xiàn)［4-18］，處方藥物的組成與待測組分的溶解性，分別考察了水、乙腈-水（體積比分別為50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10）溶液作提取溶液時(shí)的回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明，用50%乙腈-水作提取溶劑時(shí)回收率更高，因此選擇50%乙腈-水作為提取溶劑。

2.2 超聲時(shí)間的選擇

選擇50%乙腈-水作為提取溶劑進(jìn)行超聲，考察超聲處理提取時(shí)間分別為15、30、45、60 min時(shí)的回收率。結(jié)果顯示在用50%乙腈-水作提取溶劑，去離子水超聲45 min時(shí)回收率最高，因此選擇超聲時(shí)間為45 min。

2.3 色譜柱的選擇

考察了Alltechchrom Prevail carbohydrate ES型、ZORBAX Carbohydrate型、Waters Xbridge Amid型色譜柱，不同比例乙腈-水（體積比分別為50∶50、60∶40、70∶30、75∶25、80∶20、90∶10）作為流動(dòng)相時(shí)的色譜保留行為。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著乙腈比例增加，各組分分離度不斷增加，相應(yīng)分析時(shí)間也更長；乙腈∶水體積比為75∶25、80∶20時(shí)峰形較好，故綜合選擇乙腈-水（75：25）為流動(dòng)相；與其它色譜柱相比，同等條件下，ZORBAX Carbohydrate型色譜柱分離度最佳，峰寬更小，對稱性更好。因此，最終選擇ZORBAX Carbohydrate型色譜柱，乙腈-水（體積比為75∶25）作為流動(dòng)相。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取1.2中制備的溶液，按照1.3條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，空白、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。由圖1可知，陰性對照品溶液對測定無干擾，由圖2、圖3可知，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜與樣品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時(shí)間的色譜峰，說明該方法專屬性良好。

圖1 陰性對照品溶液色譜圖

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 樣品溶液色譜圖

2.5 線性關(guān)系與檢出限

分別取1.2中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.3條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以4種物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程與相關(guān)系數(shù)。取1.2中混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，以信噪比(S/N)為3時(shí)作為檢出限，信噪比(S/N)為10時(shí)作為定量限。果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限結(jié)果列于表1。由表1結(jié)果可知，各組分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 2～0.999 7。檢出限為0.034～0.083 mg/mL，定量限為0.067～0.21 mg/mL。

表1 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一樣品溶液（S1），連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.34%、0.24%、3.4%、1.4%，表明精密度較好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號（S1）樣品粉末6份，按1.2方法制備溶液，按照1.3條件進(jìn)樣，計(jì)算各成分含量及測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%、1.5%、5.0%、4.9%，表明方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

注：1)表示每100 g中的含量。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品溶液（S1），分別于溶液制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果列于表4。由表4可知，各成分色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.44%、0.36%、3.3%、2.8%，表明供試液溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取同一批號（S1）樣品粉末，分別加入標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按照1.2方法制備溶液，按照1.3條件進(jìn)樣，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果列于表5。由表5可知，4種糖類的加標(biāo)回收率為87.2%～106%，表明回收率較好。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了去離子水超聲提取，ZORBAX Carbohydrate型色譜柱分離，HPLC-RID法測定小活絡(luò)丸中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖的方法，能快速、準(zhǔn)確的分析小活絡(luò)丸輔料蜂蜜質(zhì)量的優(yōu)劣，為生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為行政監(jiān)督管理部門提供參考數(shù)據(jù)。