劉艷平，朱山，王曾，曾慶真

（1.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東菏澤 274000； 2.菏澤經(jīng)濟開發(fā)區(qū)綜合監(jiān)管部，山東菏澤 274000）

小活絡丸收載于《中華人民共和國藥典》2020年版一部，是由膽南星、制川烏、制草烏、地龍、乳香（制）、沒藥（制）六味中藥粉碎成細粉，再按照一定比例加煉蜜制成小蜜丸或大蜜丸，具有祛風散寒、化痰除濕、活血止痛的作用，用于風寒濕邪閉阻、痰疼阻絡所致的痹病，癥見肢體關節(jié)疼痛，或冷痛，或刺痛，或疼痛夜甚、關節(jié)屈伸不利，麻木拘攣［1］。由于療效確切，價格低廉，深受患者的歡迎。

蜂蜜既為輔料又是一種中藥，為蜜蜂科昆蟲中華蜜蜂或意大利蜂所釀，一般春至秋季采收。其性甘味平，具有補中、潤燥、止痛、解毒等功效；外用生肌斂瘡，用于脘腹虛痛，肺燥干咳，腸燥便秘，解烏頭類藥毒［19］。蜂蜜含有大量的還原糖，在中藥炮制、制劑中作為液體輔料用作賦形劑、黏合劑、矯味劑，能防止藥材中易氧化的成分變質(zhì)，且粘合力強，與藥粉混合后丸劑表面不易硬化，有較大的可塑性，制成的丸粒光潔，滋潤，作用持久，是一種良好的粘合劑［20］，且能增強藥效、緩和藥性。

煉蜜在小活絡丸中既作為黏合劑，又可降低制川烏、制草烏的毒性［1］。因小活絡丸價格低廉，有不法企業(yè)有可能為了降低成本，使用劣質(zhì)蜂蜜或直接摻入蔗糖、果糖、飴糖、果葡糖等代替蜂蜜［2-3］，而蜂蜜的質(zhì)量優(yōu)劣，直接影響小活絡丸本身療效。因此測定小活絡丸中蔗糖、果糖、飴糖、果葡糖漿的含量，可以輔助判斷所用輔料蜂蜜的相對優(yōu)劣［4］，同時可監(jiān)測小活絡丸的質(zhì)量與療效。

按照《中國藥典》2020年版一部，蜂蜜品種項下蔗糖、麥芽分別不得超過5.0%，果糖和葡萄糖總量不得少于60.0%，果糖與葡萄糖含量比值不得小于1.0。小活絡丸制法規(guī)定，每100 g藥粉加煉蜜120～130 g，根據(jù)上述檢驗結(jié)果與小活絡丸制法，擬定果糖與葡萄糖總量不少于30%，果糖與葡萄糖含量比值不得低于1.0；蔗糖、麥芽糖分別不得過2.5%［5-7］。

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖常用的測定方法有高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法、高效液相色譜-示差折光檢測（HPLC-RID）法、高效液相色譜-電霧式檢測器（HPLC-CAD）法、超高效合相色譜-質(zhì)譜（UPC2-MS）法、拉曼光譜法、近紅外光譜法、高效液相色譜-熒光檢測法等。HPLC-RID法由于操作簡單、線性范圍寬等優(yōu)點而被廣泛應用［8-18］。目前，小活絡丸（大蜜丸）中輔料蜂蜜含量的測定方法尚未見報道。筆者通過高效液相色譜法測定小活絡丸中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖含量，以判定輔料蜂蜜的添加量，方法簡便，穩(wěn)定可靠，可以為提高小活絡丸的質(zhì)量和安全提供重要保障。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，美國安捷倫科技公司。

電子天平：XS205型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

超聲波清洗器：KQ3200E型，昆山市超聲儀器有限公司。

乙腈：色譜純，德國默克公司。

去離子水：Milli-Q Integral純水系統(tǒng)制備。

D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標準品：批號分別為111504-201703、110833-201908、11507-201704、100287-201905，含量分別為99.8%、99.9%、99.8%、93.7%，均來自中國食品藥品檢定研究院。

膽南星：飲片，批號為190806，四川百勝藥業(yè)有限公司。

制川烏：飲片，批號為191224002，亳州市貢藥飲片廠。

制草烏：飲片，批號為190408，內(nèi)蒙古普康藥業(yè)有限公司。

地龍：飲片，批號為210214160，山東菏澤藍澤中藥飲片廠。

乳香（制）：飲片，批號為201018 ，亳州市永剛飲片廠有限公司。

沒藥（制）：飲片，批號為210309，亳州市永剛飲片廠有限公司。

小活絡丸：編號為S1、S2、S3，市售。

1.2 溶液制備

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖混合標準儲備液：取D-無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麥芽糖標準品500 mg，精密稱定，分別置于25 mL容量瓶中，加50%乙腈-水溶解稀釋至標線，搖勻，制備成質(zhì)量濃度均為20 mg/mL的4種糖類混合標準儲備液。

系列混合標準工作溶液：分別精密量取D-果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖、麥芽糖混合標準儲備液0.25、0.5、1、3、5 mL置于10 mL容量瓶中，加50%乙腈-水溶解稀釋至標線，搖勻，配制成4種糖類質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、6、10 mg/mL的系列混合標準工作溶液。

樣品溶液：將小活絡丸樣品剪碎，取1 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，精密加入25 mL 50%乙腈-水，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用50%乙腈-水補足減失的重量，混勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

陰性樣品溶液：按處方比例（每100 g藥粉加煉蜜120～130 g）及工藝，制備不添加煉蜜的陰性樣品，按照2.1.2項下方法制備相應的溶液，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Carbohydrate型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技公司），柱溫：40 ℃；流動相：乙腈-水（體積比為75∶25）；流量：1 mL/min；檢測器：示差折光檢測器；溫度：40 ℃；進樣體積：20 μL。

1.4 超聲方法

結(jié)果顯示在用50%乙腈-水作提取溶劑，水超聲45 min，

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶液的選擇

參考文獻［4-18］，處方藥物的組成與待測組分的溶解性，分別考察了水、乙腈-水（體積比分別為50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10）溶液作提取溶液時的回收率。試驗結(jié)果表明，用50%乙腈-水作提取溶劑時回收率更高，因此選擇50%乙腈-水作為提取溶劑。

2.2 超聲時間的選擇

選擇50%乙腈-水作為提取溶劑進行超聲，考察超聲處理提取時間分別為15、30、45、60 min時的回收率。結(jié)果顯示在用50%乙腈-水作提取溶劑，去離子水超聲45 min時回收率最高，因此選擇超聲時間為45 min。

2.3 色譜柱的選擇

考察了Alltechchrom Prevail carbohydrate ES型、ZORBAX Carbohydrate型、Waters Xbridge Amid型色譜柱，不同比例乙腈-水（體積比分別為50∶50、60∶40、70∶30、75∶25、80∶20、90∶10）作為流動相時的色譜保留行為。試驗結(jié)果表明，隨著乙腈比例增加，各組分分離度不斷增加，相應分析時間也更長；乙腈∶水體積比為75∶25、80∶20時峰形較好，故綜合選擇乙腈-水（75：25）為流動相；與其它色譜柱相比，同等條件下，ZORBAX Carbohydrate型色譜柱分離度最佳，峰寬更小，對稱性更好。因此，最終選擇ZORBAX Carbohydrate型色譜柱，乙腈-水（體積比為75∶25）作為流動相。

2.4 專屬性試驗

取1.2中制備的溶液，按照1.3條件進樣分析，記錄色譜圖，空白、混合標準溶液、樣品溶液色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。由圖1可知，陰性對照品溶液對測定無干擾，由圖2、圖3可知，混合標準溶液色譜與樣品溶液色譜相應位置上有相同保留時間的色譜峰，說明該方法專屬性良好。

圖1 陰性對照品溶液色譜圖

圖2 混合標準溶液色譜圖

圖3 樣品溶液色譜圖

2.5 線性關系與檢出限

分別取1.2中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖系列混合標準工作溶液，按照1.3條件進樣，記錄色譜圖。以4種物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標（x），以色譜峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，計算線性方程與相關系數(shù)。取1.2中混合標準儲備液逐級稀釋，以信噪比(S/N)為3時作為檢出限，信噪比(S/N)為10時作為定量限。果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限結(jié)果列于表1。由表1結(jié)果可知，各組分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)為0.999 2～0.999 7。檢出限為0.034～0.083 mg/mL，定量限為0.067～0.21 mg/mL。

表1 線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限

2.6 精密度試驗

精密吸取同一樣品溶液（S1），連續(xù)進樣6次，計算各成分色譜峰面積測定結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖測定結(jié)果的相對標準偏差分別為0.34%、0.24%、3.4%、1.4%，表明精密度較好。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.7 重復性試驗

取同一批號（S1）樣品粉末6份，按1.2方法制備溶液，按照1.3條件進樣，計算各成分含量及測定結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.7%、1.5%、5.0%、4.9%，表明方法重復性良好。

表3 重復性試驗結(jié)果

注：1)表示每100 g中的含量。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一份樣品溶液（S1），分別于溶液制備后0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結(jié)果列于表4。由表4可知，各成分色譜峰面積測定結(jié)果的相對標準偏差分別為0.44%、0.36%、3.3%、2.8%，表明供試液溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.9 加標回收試驗

取同一批號（S1）樣品粉末，分別加入標準溶液適量，按照1.2方法制備溶液，按照1.3條件進樣，計算加標回收率，結(jié)果列于表5。由表5可知，4種糖類的加標回收率為87.2%～106%，表明回收率較好。

表5 加標回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了去離子水超聲提取，ZORBAX Carbohydrate型色譜柱分離，HPLC-RID法測定小活絡丸中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖的方法，能快速、準確的分析小活絡丸輔料蜂蜜質(zhì)量的優(yōu)劣，為生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為行政監(jiān)督管理部門提供參考數(shù)據(jù)。