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        不同采收期迷迭香酸含量測(cè)定及響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝研究

        2022-05-26 07:31:54曾祥輝
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2022年7期
        關(guān)鍵詞:因素影響

        王 瑩,王 瑛,曾祥輝,鄧 慧

        (邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽(yáng) 422000)

        迷迭香因具有抗氧化、抑菌、安全無(wú)毒等特性利用價(jià)值廣泛,其中藥用價(jià)值、食用價(jià)值和工業(yè)價(jià)值均有概述和研究[1-6]。從迷迭香中可提取多種抗氧化元素,可分為水溶性和脂溶性?xún)深?lèi)抗氧化劑,其中水溶性抗氧化劑的組成主要有迷迭香酸和綠原酸等,研究表明水溶性抗氧化劑主要被運(yùn)用于食品加工和醫(yī)藥等方面[7]。

        迷迭香被發(fā)現(xiàn)于歐洲及地中海沿岸,于曹魏時(shí)期引種至我國(guó),在南北方均有栽種,由于我國(guó)南北方氣候差異大、土壤類(lèi)型各異等環(huán)境影響,已有學(xué)者對(duì)不同產(chǎn)地、不同采收期的植物進(jìn)行研究[8-11]。試驗(yàn)以湖南省邵陽(yáng)市種植的迷迭香為研究對(duì)象,以熱回流法為提取方法,通過(guò)HPLC 法對(duì)迷迭香酸得率進(jìn)行檢測(cè),篩選出最佳采收期的迷迭香后,通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),進(jìn)一步優(yōu)化提取條件,為擴(kuò)大迷迭香資源利用最大化提供技術(shù)支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        迷迭香,磷酸、甲醇均為色譜純,迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC 純度≥98%),大連美侖生物技術(shù)有限公司提供;無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇等均為分析純;去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

        SY-1210 型恒溫水浴鍋,南京暢翔儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;3H16RI 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品;BON-80 型電熱干燥箱,上海三騰儀器有限公司產(chǎn)品;SR-3000 型高效液相色譜儀,Thermo Fisher 公司產(chǎn)品。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 樣本預(yù)處理

        將不同采收期的迷迭香置于45 ℃干燥箱中烘至恒質(zhì)量,經(jīng)粉碎機(jī)處理后過(guò)篩分別置于密封袋中保存,備用。

        1.2.2 提取工藝流程

        采用熱回流法[12]。迷迭香粉末→按比例加入溶劑提取→離心→定容→過(guò)微孔濾膜→成品→HPLC 檢測(cè)。

        稱(chēng)取定量迷迭香粉末置于燒瓶中,按所設(shè)定的提取條件采取回流法對(duì)迷迭香水溶性物質(zhì)進(jìn)行提取。將提取后的溶液離心并定容,取樣液過(guò)微孔濾膜進(jìn)行HPLC 分析。

        1.3 提取工藝優(yōu)化

        1.3.1 單因素試驗(yàn)

        稱(chēng)取定量迷迭香粉末,以提取溫度(40,50,60,70,80 ℃)、提取時(shí)間(40,50,60,70,80 min)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%,50%,60%,70%,80%) 和料 液 比(1 ∶10,1 ∶20,1 ∶30,1 ∶40,1 ∶50(g∶mL)) 為影響因素,在固定其中3 個(gè)提取條件不變的情況下,考查4 個(gè)影響因素在不同水平下對(duì)迷迭香酸得率的影響。

        1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

        通過(guò)單因素試驗(yàn)得出最優(yōu)的提取條件后,采用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行Box-behnken 方法設(shè)計(jì),響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)為四因素三水平,以提取溫度50 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,提取時(shí)間70 min,料液比1∶20 為中心試驗(yàn)點(diǎn)展開(kāi)試驗(yàn)。

        響應(yīng)面優(yōu)化的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

        表1 響應(yīng)面優(yōu)化的因素與水平設(shè)計(jì)

        1.4 迷迭香酸含量測(cè)定

        1.4.1 色譜條件

        參考GB 1886.172—2016,使用高效液相色譜法測(cè)定迷迭香酸的含量[13]。使用C18反向色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm),設(shè)置流動(dòng)相B 為0.5 %磷酸- 甲醇(體積比為55∶45),檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm,柱溫為40 ℃,流速為0.6 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL,檢測(cè)時(shí)間15 min。

        1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

        精密量取迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品,溶解制成0,0.125,0.250,0.500,1.000 mg/mL 質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,參考1.4.1 色譜條件進(jìn)行色譜分析。以迷迭香酸含量為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以峰面積(Y) 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X) 進(jìn)行回歸分析,得到方程Y=322.028 1X-5.027 8,其相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9,此方程可精確計(jì)算出迷迭香樣品中迷迭香酸的具體含量。

        1.4.3 迷迭香酸得率的計(jì)算

        以HPLC 分析,積分計(jì)算樣品溶液迷迭香酸吸收峰面積,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算迷迭香酸質(zhì)量濃度。按下式計(jì)算迷迭香酸得率(Y)。

        式中:c——迷迭香酸樣品質(zhì)量濃度,mg/mL;

        V——試樣溶液定容體積,mL;

        m——試樣質(zhì)量,mg。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        用Excel、Design Expert 8.0.6.1 等軟件進(jìn)行繪圖、響應(yīng)面優(yōu)化等數(shù)據(jù)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量的測(cè)定

        不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量見(jiàn)表2。

        表2 不同采收期迷迭香中迷迭香酸含量/%

        迷迭香酸含量呈先升后降的趨勢(shì),當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間為10 個(gè)月時(shí)其含量最高,為0.148%;當(dāng)采收期為8 個(gè)月、24 個(gè)月時(shí),分別為0.138%和0.142%。由此可見(jiàn),在迷迭香的生長(zhǎng)過(guò)程中,當(dāng)采收期為10 個(gè)月時(shí)迷迭香酸含量已達(dá)最高值,考慮到實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益,故選取采收期為10 個(gè)月的迷迭香樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

        2.2 單因素試驗(yàn)

        2.2.1 提取溫度對(duì)迷迭香酸得率的影響

        提取溫度對(duì)迷迭香酸得率的影響見(jiàn)圖1。

        圖1 提取溫度對(duì)迷迭香酸得率的影響

        由圖1 可知,在40~80 ℃范圍內(nèi),迷迭香酸得率隨溫度變化呈上升趨勢(shì),當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到較高值,而后在50~80 ℃范圍內(nèi)迷迭香酸得率相差量小。分析原因可能是,當(dāng)水溫在50 ℃以下時(shí),未達(dá)到迷迭香酸的溶點(diǎn),致使迷迭香酸的溶出率較低;但由于迷迭香酸的耐熱性較好,所以當(dāng)水熱在一定范圍內(nèi)時(shí),迷迭香酸溶出率的差異較小,基于實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,故選取50 ℃為提取迷迭香酸的最佳溫度。

        2.2.2 提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸得率的影響

        提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸得率的影響見(jiàn)圖2。

        圖2 提取時(shí)間對(duì)迷迭香酸得率的影響

        由圖2 可知,在40~80 min 內(nèi),迷迭香酸得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升,當(dāng)提取時(shí)間為70 min時(shí)達(dá)到峰值,之后隨時(shí)間的增加而下降。這可能是由于迷迭香酸的穩(wěn)定性較差,長(zhǎng)時(shí)間的提取使其他副產(chǎn)物溶出,造成迷迭香酸含量降低的現(xiàn)象,因此選取70 min 為最佳提取時(shí)間。

        2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)迷迭香酸得率的影響

        乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)迷迭香酸得率的影響見(jiàn)圖3。

        圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)迷迭香酸得率的影響

        由圖3 可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%~80%時(shí),迷迭香酸得率總體呈先升后降的趨勢(shì),當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),迷迭香酸得率達(dá)到峰值,之后迷迭香酸的得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而下降。可能是由于迷迭香酸為水溶性物質(zhì),低體積分?jǐn)?shù)的乙醇更利于其溶出,而高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會(huì)使其他的物質(zhì)溶出增多,使得迷迭香酸得率下降[14],故選取50%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

        2.2.4 料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響

        料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響見(jiàn)圖4。

        圖4 料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響

        由圖4 可知,料液比在1∶10~1∶50 范圍內(nèi),迷迭香酸得率大致呈先增后減現(xiàn)象,在1∶10~1∶20時(shí)該得率大幅度上升,但當(dāng)料液比大于1∶20 時(shí),迷迭香酸得率隨料液比的增加變化量小。可能是由于適當(dāng)增加溶劑用量會(huì)提高迷迭香粉末與溶劑的溶解度,有助于溶出迷迭香酸,但當(dāng)料液比超過(guò)1∶20時(shí),迷迭香酸溶出速率達(dá)動(dòng)態(tài)平衡,導(dǎo)致其他活性成分與迷迭香酸產(chǎn)生相互溶出的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,迷迭香酸提取量反而降低,加之過(guò)多的提取溶劑會(huì)造成資源浪費(fèi)和成本增加[15]。故選取1∶20 為最優(yōu)料液比。

        2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

        2.3.1 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以提取溫度(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、料液比(C) 及提取時(shí)間(D) 為試驗(yàn)因子進(jìn)行四因素三水平Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì),以迷迭香酸得率(Y) 為響應(yīng)值,得到在不同條件下提取迷迭香酸的結(jié)果。

        響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

        運(yùn)用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行回歸分析得到迷迭香酸得率(Y) 的回歸方程為:

        迷迭香酸得率方差分析見(jiàn)表4。

        由表4 可知,該回歸模型F=96.44,p<0.000 1,表明該試驗(yàn)的回歸方程呈極顯著水平,表明該模型有較高可信度,該方程可以較好地預(yù)測(cè)迷迭香酸的得率。模型的決定系數(shù)R2=0.989 7,調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.979 5,說(shuō)明該模型可以應(yīng)用于分析迷迭香酸得率變化情況,擬合度較高。失擬項(xiàng)p=0.547 6>0.05,差異不顯著,表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小,模型內(nèi)容合適,可應(yīng)用于對(duì)迷迭香酸提取工藝優(yōu)化進(jìn)行分析。除此之外,由表4 可知,料液比的影響極顯著,乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響顯著,根據(jù)F 值可知,各因素對(duì)迷迭香酸得率的影響情況依次為C>B>A>D;二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。

        表4 迷迭香酸得率方差分析

        2.3.2 因素間交互作用分析

        考查了提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和料液比這4 個(gè)影響因子中各因素間的相互作用對(duì)迷迭香酸得率產(chǎn)生的影響。

        各因素間交互作用對(duì)迷迭香酸得率的影響見(jiàn)圖5。

        在響應(yīng)面圖中,如果圖中坡度越陡則表示迷迭香酸的提取率受該因素的影響越大,反之則影響次之。由圖5 可知,料液比的增加明顯促進(jìn)了迷迭香酸的得率,當(dāng)料液比為1∶10~1∶20(g∶mL) 時(shí),迷迭香酸得率顯著增長(zhǎng),說(shuō)明料液比對(duì)迷迭香酸得率的影響極大;此外,當(dāng)提取溫度在40~60 ℃時(shí),迷迭香酸得率較為一致,說(shuō)明該影響因素的變化對(duì)迷迭香酸得率的影響較小,該結(jié)果與方差分析的結(jié)果相一致。

        圖5 各因素間交互作用對(duì)迷迭香酸得率的影響

        根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳提取條件為提取溫度50.63 ℃,提取時(shí)間69.45 min,料液比1∶23.66(g∶mL),乙醇體積分?jǐn)?shù)50.94%,迷迭香酸得率預(yù)測(cè)值為1.27%。根據(jù)實(shí)際情況將提取條件整合為提取溫度51 ℃,提取時(shí)間69 min,料液比1∶24(g∶mL),乙醇體積分?jǐn)?shù)51%,在此條件下進(jìn)行3 次水平試驗(yàn),平均得率為1.24%,實(shí)際結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果誤差為0.03%(<5%),說(shuō)明模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)驗(yàn)證值之間差異較小,證明此模型具有較高可行性。

        2.4 方法可行性分析

        2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)

        定量稱(chēng)取迷迭香粉末,按上述最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行回流提取,分別取6 份提取液供HPLC 分析,經(jīng)計(jì)算可知迷迭香酸得率為1.23%,與預(yù)測(cè)值誤差僅為0.04%,說(shuō)明重復(fù)性較好[16]。

        2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        以最優(yōu)工藝參數(shù)制作提取液,置于室溫保存,分別于0,2,4,6,8 h 進(jìn)樣檢測(cè),記錄迷迭香酸樣品量,計(jì)算各樣品間的標(biāo)準(zhǔn)偏差為SD=0.05%,表明該提取液在室溫下8 h 內(nèi)較穩(wěn)定[16]。

        3 結(jié)論

        通過(guò)對(duì)5 個(gè)不同采收期的迷迭香進(jìn)行含量測(cè)定,得到迷迭香酸含量最高的采收期為10 個(gè)月,該采收期的迷迭香中抗氧化物質(zhì)含量高,且采收期較短,可更好地為迷迭香產(chǎn)業(yè)化發(fā)展助力。后又以該采收期的迷迭香進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析,對(duì)迷迭香酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)表明,在提取溫度為51 ℃,提取時(shí)間為69 min,料液比為1∶24(g∶mL),乙醇體積分?jǐn)?shù)為51%時(shí),迷迭香酸得率為1.26%,與模型預(yù)測(cè)值1.27%無(wú)顯著差異,且該模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.979 5,證明該方案具有較高可行性。研究成果對(duì)湖南省邵陽(yáng)市種植迷迭香的生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義,同時(shí)為該地區(qū)迷迭香生產(chǎn)加工和迷迭香酸提取工業(yè)化提供理論基礎(chǔ)。

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