余 芳，汪洪濤，鄭夢瑤，朱龍龍

（1. 江蘇經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康學(xué)院，江蘇南京 211168；2. 江蘇省食品安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心，江蘇南京 210000；3. 南京諾衛(wèi)檢測有限公司，江蘇南京 211168）

0 引言

辣木（Moringa oleifera Lam） 為辣木科辣木屬植物，我國南方地區(qū)多有種植。辣木葉和辣木籽是極具開發(fā)潛力的新資源食品，具有降低血壓和膽固醇、抗氧化、抑菌、輔助減肥等作用[1-3]。辣木鮮葉在印度被當(dāng)成蔬菜食用，在我國主要做成茶葉飲用[4]。辣木籽具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，其蛋白質(zhì)含量為35.8%，多糖含量為19.1%[5]。辣木茶是新鮮辣木葉經(jīng)過清洗、晾曬、攤涼、萎凋、殺青、攤涼、渥堆、揉捻、烘干等工藝制成，采用類似茶葉沖泡（浸泡或煮） 的方式供人們飲用的產(chǎn)品[6-7]。辣木茶富含蛋白質(zhì)、多酚類物質(zhì)及礦物元素[8-10]，能夠降低老年人的尿酸水平[11]，對氯氰菊酯誘導(dǎo)的雌性大鼠肝腎功能損傷、氧化應(yīng)激及組織病理學(xué)改變的保護(hù)作用，對·OH 和·O2-具有較強(qiáng)的清除作用[12-14]。

目前，有學(xué)者研究了辣木葉多酚提取及抗氧化活性[15-16]，辣木葉發(fā)酵制成的辣木茶生物活性研究較少。試驗(yàn)以市售辣木茶為原料，參照人們?nèi)粘ｏ嫴璧纳盍?xí)慣，通過高溫水提的方式，考查料液比、提取溫度、提取時(shí)間對辣木茶多酚提取量的影響。采用單因素試驗(yàn)和Box-behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化辣木茶多酚提取工藝，選擇最佳提取工藝參數(shù)。測定清除DPPH 自由基能力、超氧陰離子清除能力及總還原力，評(píng)價(jià)辣木茶溶液體外抗氧化活性，以期深入開發(fā)利用辣木保健茶資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木茶，市售，產(chǎn)自云南昆明，水分含量5.8%，經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎后，密封儲(chǔ)存于冰箱-18 ℃冷凍層備用；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑、Tris-HCl、維C 標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH 等，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

FW100 型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；BSA224S 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JH 722s 型可見光分光光度計(jì)，上海菁華儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣木茶多酚含量測定

按照《GB/T 8313—2018 茶葉中茶多酚及兒茶素類檢測方法》[17]，配制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10%福林酚試劑5 mL，搖勻，反應(yīng)5 min，再加入7.5% Na2CO3溶液4 mL，室溫靜置60 min，于波長765 nm 處測定吸光度，得到回歸方程Y=0.246 4X+0.042 2，R2=0.998 8。該測定方法線性關(guān)系良好，依此進(jìn)行辣木茶多酚含量測定。

1.3.2 辣木茶多酚提取工藝單因素試驗(yàn)

稱取辣木茶粉2 g，固定溫度70 ℃，浸提時(shí)間30 min，設(shè)定料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60；固定料液比1∶30，溫度70 ℃，設(shè)定提取時(shí)間10，20，30，40，50 min；固定料液比1∶30、浸提30 min，設(shè)定提取溫度50，60，70，80，90 ℃，測定辣木茶多酚提取量。

1.3.3 辣木茶多酚提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)1.3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)Box-behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，以辣木茶多酚提取量為考查指標(biāo)。

Box-behnken 中心組合設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-behnken 中心組合設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 辣木茶體外抗氧化試驗(yàn)

（1） 辣木茶清除DPPH 自由基能力測定。分別稱取0，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 g 的辣木茶粉，加入80 ℃水溶解，冷卻后定容到100 mL，配制質(zhì)量濃度分別為0，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 mg/mL 的辣木茶溶液，過濾取濾液，根據(jù)Vattem D A 等人[18]方法對其進(jìn)行DPPH 自由基清除率測定，以相同濃度的維C 溶液為陽性對照，并按下式計(jì)算不同溶液對DPPH 自由基的清除率。

式中：A0——2 mL DPPH+2 mL 70%乙醇溶液于波長517 nm 處測得的吸光度；

Ai——2 mL DPPH+2 mL 辣木茶溶液于波長517 nm 處測得的吸光度；

Ai0——2 mL 70%乙醇溶液+ 2 mL 辣木茶溶液于波長517 nm 處測得的吸光度。

（2） 辣木茶對·O2-的清除能力測定。取1.3.4（1） 相同質(zhì)量濃度的辣木茶溶液，進(jìn)行·O2-的清除能力測定，以相同質(zhì)量濃度的維C 溶液為陽性對照。參照張秀芬等人[14]方法，配制0.05 moL/L，pH 值8.2的Tris-HCl 溶液、45 mmoL/L 鄰苯三酚溶液備用。于10 mL 試管中依次加入試劑，反應(yīng)4 min，測定波長340 nm 處不同樣品液的吸光度，按式計(jì)算·O2-清除率：

式中：A0——2.55 mL Tris-HCl+0.05 mL 鄰苯三酚+0.4 mL 蒸餾水于波長340 nm 處測得的吸光度；

A1——2.55 mL Tris-HCl+0.05 mL 鄰苯三酚+0.4 mL 辣木茶溶液于波長340 nm 處測得的吸光度；

A2——2.55 mL Tris-HCl+0.4 mL 辣木茶溶液+0.05mL 蒸餾水于波長340 nm 處測得的吸光度。

（3） 辣木茶總還原力測定。分別稱取0，0.020，0.040，0.060，0.080，0.100 g 的辣木茶粉，加入80 ℃水溶解，冷卻后定容到100 mL，配制成0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL 的辣木茶溶液，過濾后進(jìn)行總還原力測定，以0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL 維C 溶液為陽性對照。參照裴斐等人[15]方法，取不同質(zhì)量濃度的樣品液1.0 mL，測定其波長700 nm 吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，p<0.05，差異顯著；p<0.01，差異極顯著。測定結(jié)果均平行重復(fù)3 次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

料液比對辣木茶多酚提取量的影響見圖1，提取時(shí)間對辣木茶多酚提取量的影響見圖2，提取溫度對辣木茶多酚提取量的影響見圖3。

圖1 料液比對辣木茶多酚提取量的影響

圖2 提取時(shí)間對辣木茶多酚提取量的影響

圖3 提取溫度對辣木茶多酚提取量的影響

由圖1 可知，隨著料液比的增大，辣木茶多酚提取量在不斷增大，1∶40 時(shí)多酚提取量達(dá)到最高值，這是由于溶劑用量增加有利于多酚的溶出。隨著料液比從1∶50 開始，提取量有所下降，說明隨著溶劑量的增加，提取過程中溶出的其他水溶性物質(zhì)如多糖等，影響了辣木茶多酚的提取分離。由圖2可知，20 min 時(shí)達(dá)到最大提取量，表明提取液中多酚已基本溶出，提取時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致茶多酚被氧化而降低[14]。依據(jù)日常飲茶習(xí)慣的時(shí)間間隔，以及多酚的變化規(guī)律，選擇水提時(shí)間10，20，30min 作為響應(yīng)面試驗(yàn)的3 個(gè)水平。由圖3 可知，隨著溫度的升高，溶液的分子運(yùn)動(dòng)加快，多酚的溶解度不斷增大，且高溫導(dǎo)致細(xì)胞膜破損，有利于有效成分的溶出[19]。溫度選擇要考慮到日常沏茶常用水溫度及飲茶習(xí)慣溫度。

2.2 辣木茶多酚提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)進(jìn)行辣木茶多酚提取工藝的Box-behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，按照表1 的設(shè)計(jì)方案，以辣木茶多酚提取量為考查指標(biāo)，17 個(gè)不同組合的試驗(yàn)結(jié)果。

Box-behnken 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-behnken 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

2.3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

應(yīng)用Design Expert 8 軟件對表2 的試驗(yàn)結(jié)果回歸擬合，得到A、B、C 各因素對辣木茶多酚提取量（Y） 影響的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

回歸模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表5 可知，F(xiàn)=20.99，p=0.000 3<0.01，回歸模型顯著，擬合程度和可信度較好，試驗(yàn)誤差較小，極顯著。其中，料液比和提取溫度2 個(gè)因素對辣木茶多酚提取量的影響極顯著，模型失擬項(xiàng)不顯著（p=0.758 8>0.05），則此模型擬合度良好。

2.4 提取工藝條件的響應(yīng)曲面分析

根據(jù)Design Expert 8 軟件對表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到不同提取條件對辣木茶多酚提取量影響的三維響應(yīng)面圖。

兩因素的交互作用對辣木茶多酚提取量的影響見圖4。

圖4 兩因素的交互作用對辣木茶多酚提取量的影響

由圖4 可知，兩因素的交互作用對辣木茶多酚提取量的影響，分析3 個(gè)響應(yīng)面曲線圖可知，料液比與提取溫度2 個(gè)因素對辣木茶多酚提取量的影響顯著，曲線較為陡峭，提取時(shí)間對辣木茶多酚提取量的影響較小，曲線較為平緩。

2.5 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證

應(yīng)用Design Expert 8 軟件進(jìn)行最佳提取條件為料液比1∶42.12，提取時(shí)間19.35 min，提取溫度83.81 ℃，多酚提取量為32.13 mg/g。提取工藝修正為料液比1∶40，提取時(shí)間20 min，提取溫度80 ℃。在此優(yōu)化條件下提取辣木茶多酚，實(shí)際提取量為31.67±1.48 mg/g，與理論值非常接近，說明該多元二次回歸方程能夠準(zhǔn)確預(yù)測辣木茶多酚的實(shí)際提取量。Fombang E N 等人[20]利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件溫度、料液比和時(shí)間，制備具有抗氧化潛力的富含植物化學(xué)的辣木功能性茶為料液比1∶20（mg∶mL），提取溫度97 ℃，提取時(shí)間35 min，總多酚的最佳提取量為56.96 mg/g。研究相比之下減少了提取時(shí)間，降低了提取溫度，與后者料液比相差1 倍，稀釋后多酚提取量接近或超過，因此更符合日常多開飲茶習(xí)慣。

2.6 辣木茶溶液體外抗氧化活性

2.6.1 辣木茶清除DPPH 自由基能力

DPPH 是在含有自由基的化學(xué)反應(yīng)中作為一種監(jiān)測反應(yīng)的物質(zhì)，典型地用于實(shí)驗(yàn)室研究中抗氧化成分的體外抗氧化性評(píng)價(jià)。

辣木茶溶液與維C 溶液清除DPPH 自由基能力見圖5。

圖5 辣木茶溶液與維C 溶液清除DPPH 自由基能力

由圖5 可知，質(zhì)量濃度為1.25～20.00 mg/mL 時(shí)，辣木茶溶液具有很強(qiáng)的清除DPPH 自由基能力，清除率為94.10%～93.72%，質(zhì)量濃度為1.25～10.00 mg/mL時(shí)，辣木茶溶液清除DPPH 自由基能力高于同濃度維C。

2.6.2 辣木茶對·O2-的清除能力

超氧陰離子（·O2-） 與羥基（-OH） 結(jié)合后的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA 損壞，應(yīng)用清除超氧陰離子（·O2-） 能力可評(píng)價(jià)抗氧化能力。

辣木茶溶液與維C 溶液清除·O2-能力見圖6。

圖6 辣木茶溶液與維C 溶液清除·O2-能力

由圖6 可知，質(zhì)量濃度1.25～20.00 mg/mL 范圍內(nèi)的辣木茶溶液具有一定的清除超氧陰離子能力，并隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸增高，20 mg/mL 時(shí)達(dá)到36.65%，相當(dāng)于同濃度維C 溶液（91.16%） 的40.20%。

2.6.3 辣木茶總還原力

利用抗氧化劑將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再利用三價(jià)鐵形成普魯士藍(lán)，可由波長700 nm 處的吸光度變化來檢測總還原力大小[21]。

辣木茶溶液與維C 溶液總還原力見圖7。

圖7 辣木茶溶液與維C 溶液總還原力

由圖7 可知，在質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL 范圍內(nèi)，辣木茶溶液和維C 溶液的吸光值隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，說明其總還原力隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸升高。在質(zhì)量濃度為0.2～0.6 mg/mL 時(shí)，辣木茶溶液和維C 溶液的吸光度很接近，在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL 時(shí)，辣木茶溶液的總還原力為0.579，維C溶液總還原力為1.241。

Sugahara S 等人[13]研究結(jié)果表明，辣木茶熱水提取物具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基和超氧陰離子能力，并隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸增高，其EC50 分別為73.7 μg/mL 和246 μg/mL。Fombang E N 等 人[20]試驗(yàn)結(jié)果表明，在該優(yōu)化提取條件下制備的辣木茶多酚對DPPH 自由基的清除率為81%，略高于抗壞血酸維C（77%），總還原能力為1.75 g 抗壞血酸當(dāng)量/100 g。

3 結(jié)論

依據(jù)日常的飲茶習(xí)慣，選取了定比熱水浸提的單因素試驗(yàn)和Box-behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化辣木茶多酚提取工藝為料液比1∶42.12，提取時(shí)間為19.35 min，提取溫度83.81 ℃，修正后的優(yōu)化條件下多酚提取量為31.67±1.48 mg/g，所得回歸模型應(yīng)用性良好。測定辣木茶溶液的清除DPPH 自由基能力、清除超氧陰離子能力及其總還原力，證明了辣木茶具有一定的體外抗氧化活性，為開發(fā)辣木保健茶資源提供理論基礎(chǔ)。辣木茶發(fā)酵過程中是否造成多酚的富集，以及辣木茶多酚是否為辣木茶體外抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者等科學(xué)問題，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。