王 帆，王 靜，黃 愷，彭 淵，劉成海,，陶艷艷*

1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所；2上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203

馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)天然存在于馬兜鈴科植物中，具有抗腫瘤、抗感染、抗炎等功效，含AA的中藥及成藥制劑廣泛應(yīng)用于臨床[1]，包括馬兜鈴屬木香、防己、朱砂蓮、細(xì)辛屬的細(xì)辛、山慈菇等中藥以及復(fù)方胃痛膠囊、喘息靈膠囊、十三味疏肝膠囊等中成藥[2]。研究也表明，AA暴露與腎病和上尿路癌的發(fā)生存在高風(fēng)險相關(guān)[3]；作為AA的主要成分之一，馬兜鈴酸I(aristolochic acid I，AAⅠ)同樣具有腎毒性與致癌性[4]；長期服用含此類物質(zhì)的中藥可引起馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)[5]。目前已有不少關(guān)于AAI腎毒性的研究，但全面表征其毒理機(jī)制的報道并不多[6]，大多為針對某一細(xì)胞或者信號通路的研究。因此仍需要進(jìn)一步探索AAI毒性機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組是細(xì)胞內(nèi)所有基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和[7]，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是對轉(zhuǎn)錄組的研究，涵蓋了與RNA相關(guān)的內(nèi)容，如轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、功能等。為了更全面了解AAI腎毒性機(jī)制，本研究采用IIIumina高通量測序平臺對腎組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，進(jìn)行差異表達(dá)及GO、KEGG富集分析，以明確AAI致腎毒性的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物

AAI(純度>98.5%，批號：3503)，購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，4 ℃冰箱存放備用；羧甲基纖維素鈉(批號：F20051103)，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠15只，體質(zhì)量23～25 g，6～8周齡，SPF級，購于上海南方模式生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0010。于上海南方模式生物科技股份有限公司SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，動物使用許可證號：SYXK(滬)2019-0003。所有操作均由上海南方模式生物科技股份有限公司實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批通過(審批號：IACUC號2018-0026)。

1.1.3 試劑

血肌酐(serum creatinine，Scr)試劑盒(批號：20150526)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)試劑盒(批號：20150511)均購自南京建成生物工程研究所；Trizol Reagent(批號：F919KB3054)、總RNA提取試劑盒(批號：B518811)均購自上海生工生物工程股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：AJ92014A，日本TAKARA公司)；擴(kuò)增試劑盒(批號：AJF0343A，日本TAKARA公司)。

1.1.4 主要儀器

實時熒光定量PCR儀(美國Life Technonogy公司)；熒光倒置顯微鏡(Olympus IX70，日本)。

1.2 方法

1.2.1 AAI溶液配置

100 mg羧甲基纖維素鈉溶解于20 mL雙蒸水中配置成0.5%的混懸液。40 mg AAI加入20 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液中制備成2 mg/mL貯存液，超聲震蕩直至完全溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動物分組及模型建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組(N，n=6)和模型組(M，n=9)。模型組小鼠以AAI 20 mg/kg劑量連續(xù)腹腔注射，每天1次，連續(xù)5天，正常組小鼠注射相同容積的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液。

1.2.3 樣本采集

造模第6日，小鼠用3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，打開腹腔取下腔靜脈血，置于-80 ℃冰箱保存，用于測定Scr、BUN。摘除腎臟，一側(cè)腎臟組織沿矢狀面剖開，取二分之一用4%甲醛固定，用于HE染色；另取100 mg腎組織存于Trizol中用于提取RNA。

1.2.4 血清檢測及HE染色

按試劑盒說明書進(jìn)行Scr、BUN水平的檢測。腎組織經(jīng)4%中性甲醛緩沖液固定，自動脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。腎組織病理改變參照文獻(xiàn)[8]以評估腎小管和腎間質(zhì)病變程度。

1.2.5 腎組織RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

Trizol提取腎組織總RNA，Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)進(jìn)行質(zhì)量檢測；使用Qubit 2.0 RNA檢測試劑盒測定RNA濃度，包括mRNA分離/片段化、雙鏈DNA合成、末端修復(fù)、末端dA-Tailing、橋頭連接、連接產(chǎn)物純化、片段大小分選以及文庫擴(kuò)增等；精確定量后回收的DNA，按1∶1比例定量混合，IIIumina HiSeq X Ten測序儀用于測序，產(chǎn)生150 bp的雙端數(shù)據(jù)。建庫測序及數(shù)據(jù)分析部分由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.2.6 質(zhì)量控制及參考基因組比對

使用Trimmomatic(version 0.36)軟件進(jìn)行質(zhì)控并去除接頭，在此基礎(chǔ)上過濾掉低質(zhì)量堿基以及N堿基，最終得到高質(zhì)量的Clean reads。hisat2(v2.2.1.0)軟件用于將得到的Clean Reads與小鼠參考基因組(從NCBI中下載參考基因組，基因組版本為GRCm38.p6)進(jìn)行序列比對，以獲取在參考基因組或基因上的位置信息和測序樣品特有的序列信息。各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在5.99～6.83 G，Q30堿基分布在93.97%～95.01%，平均GC含量為47.90%。通過將reads比對到參考基因組上，得到各個樣本的基因組比對情況，比對率為92.6%～98.23%。

1.2.7 差異表達(dá)基因篩選

導(dǎo)出各樣本測序結(jié)果，并運用R語言中的“Affy”“l(fā)imma”軟件包分析差異表達(dá)基因。Affy包去除原始數(shù)據(jù)中系統(tǒng)誤差，從而得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)；Limma包用于對正常組織和腎損傷組織標(biāo)準(zhǔn)化之后的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析。篩選條件為P<0.01且差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥2.0，獲取上調(diào)和下調(diào)的差異基因。使用Pheatmap包繪制熱圖和火山圖。

1.2.8 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

得到差異表達(dá)基因后，采用“clusterProfiler”“colorspace”“enrichplot”“ggplot2”“org.Mm.eg.db”“stringi”R語言包對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，篩選條件為P.value cutoff<0.05和Q.value cutoff<0.05。計算生物學(xué)過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)以及分子功能(molecular function，MF)的基因富集數(shù)，最后將排名前20的GO生物過程和KEGG通路繪制為氣泡圖。

1.2.9 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

基于轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，選擇兩組間FC最為明顯的前5個基因(見圖3)進(jìn)行qRT-PCR驗證。使用NCBI在線引物設(shè)計軟件Primer-Blast設(shè)計引物，由上海生工生物工程有限公司合成(基因名稱、引物序列見表1)。Trizol提取腎組織總RNA，采用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照SYBR Premix Ex Taq II熒光染料法實時定量試劑盒說明進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，每個樣品重復(fù)3次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△CT法進(jìn)行分析定量。

表1 熒光定量PCR各基因引物序列

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AAI處理小鼠腎損傷的血清生化和腎組織病理變化

分別對正常組、模型組小鼠進(jìn)行血清生化檢測與腎組織HE染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組小鼠Scr增高約12倍、BUN增高約3倍(見圖1A、圖1B)。HE染色顯示，正常腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管、腎間質(zhì)均未見到明顯改變；模型組腎小球水腫、腎小球固縮，近曲小管上皮細(xì)胞脫落(見圖2)。

圖1 正常組與模型組小鼠血清生化變化

圖2 正常組與模型組小鼠腎組織病理變化(×100，標(biāo)尺=100 μm)

2.2 AAI處理小鼠腎損傷差異表達(dá)基因篩選及GO富集分析

對AAI處理小鼠表達(dá)差異基因進(jìn)行篩選與GO富集分析(見圖3)。發(fā)現(xiàn)達(dá)到篩選標(biāo)準(zhǔn)的基因(FC≥2.0且P值<0.01)共有4 975個，其中上調(diào)基因有2 511個，下調(diào)基因有2 464個。熱圖(見圖3A)顯示出多個基因在兩個組別中的表達(dá)水平。與正常組相比，模型組主要有以下基因發(fā)生差異性表達(dá)：Kap、Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc等。火山圖(見圖3B)用于展示基因表達(dá)差異的分布，其中橫軸為差異倍數(shù)的對數(shù)，越偏離中心差異倍數(shù)越大；縱軸為多差異顯著性P值的負(fù)對數(shù)，值越大表明差異越顯著，紅點代表顯著上調(diào)的基因，綠點代表顯著下調(diào)的基因。

圖3 AAI作用下正常組與模型組小鼠差異表達(dá)基因

2.3 AAI處理小鼠腎損傷差異表達(dá)基因的生物功能分析

為進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能及其在分子水平上的作用，并針對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋(見圖4)。Gene Ratio表明差異基因中與該Term相關(guān)的基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，圓圈大小代表基因的多少，Qvalue為對P值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗的Q值，Qvalue值越小說明富集程度越明顯。

圖4 AAI作用下差異表達(dá)基因的GO注釋

GO-BP分析顯示涉及的生物學(xué)過程主要有：小分子分解代謝過程；中性粒細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答；胞外間質(zhì)組織；脂肪酸代謝過程；有機(jī)酸分解代謝過程；羧酸分解代謝過程；對有毒物質(zhì)的反應(yīng)；免疫應(yīng)答；對金屬離子的反應(yīng)；血小板脫粒等。

GO-CC分析結(jié)果提示涉及的細(xì)胞組分主要有：顆粒腔；細(xì)胞質(zhì)囊泡腔；質(zhì)膜的外側(cè)；含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)；血液微粒；血小板α顆粒；過氧化物酶基質(zhì)；微體腔等。

GO-MF分析結(jié)果提示涉及的分子功能主要有：硫化合物的結(jié)合；酰胺結(jié)合；氧化還原酶活性；抗氧化活性；氨肽酶活性；過氧化物酶活性；胱甘肽過氧化物酶活性等。

2.4 馬兜鈴酸I處理小鼠腎損傷差異表達(dá)基因的KEGG分析

對AAI作用下表達(dá)的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析(見圖5)，其中富集因子(enrichment score，ES)代表基因的富集程度，P-value值越接近0表示富集程度越顯著。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AAI處理后腎損傷相關(guān)的通路包括JAK-STAT、NF-κB、PPAR信號通路；補體系統(tǒng)激活和凝血級聯(lián)反應(yīng)；過氧化反應(yīng)；糖酵解/糖異生、胰島素抵抗；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解；類固醇激素合成等途徑。

圖5 AAI作用下差異表達(dá)基因KEGG富集分析

2.5 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

在表達(dá)的差異基因中挑選5個差異基因，以β-actin為內(nèi)參，運用qRT-PCR以驗證RNA-seq的可靠性(見圖6)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組Kap基因表達(dá)量明顯減少；Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc基因表達(dá)量顯著增加，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，驗證了轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的可靠性。

3 討論與結(jié)論

AA的毒性作用早在20世紀(jì)90年代已被報道，隨后被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一級致癌物[9]。目前我國已禁止諸如廣防己、關(guān)木通等AA含量較高藥材的使用，而相對含量較低的馬兜鈴科植物及其制劑仍應(yīng)用于臨床治療[10]。AAI是AA的主要成分，不同中藥材中AAI含量亦不同，如細(xì)辛類藥材中AAI含量在10 μg/g左右[11]，朱砂蓮中AAI的含量介于0.938 6～3.567 5 mg/g之間[12]。朱砂蓮臨床給藥5～10 g時AAI量達(dá)到9.386～35.675 mg之間。本文參考他人研究[13,14]，小鼠以AAI 20mg/kg劑量給藥5天，即出現(xiàn)明顯腎損傷：血肌酐、尿素氮均明顯升高；腎小球水腫、腎小球固縮，近曲小管上皮細(xì)胞脫落。

RNA-seq是以高通量測序技術(shù)為基礎(chǔ)，對組織細(xì)胞中的所有mRNA進(jìn)行高通量測序分析的技術(shù)。本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)對AAI處理的小鼠腎組織RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與正常組差異表達(dá)基因共4 975個，其中上調(diào)的基因有2 511個，下調(diào)的基因有2 464個，其中差異表達(dá)基因中前5位為kap、Spp1、Aldh1a2、Serpine1、Tnc。

Kap為腎臟雄激素調(diào)節(jié)蛋白，是腎臟近端腎小管細(xì)胞中一種具有高度特異性，并且受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)的蛋白，研究表明Kap與親環(huán)蛋白B相互作用可以保護(hù)近端小管細(xì)胞免受環(huán)孢霉素A毒性的影響[15]。Spp1也被稱為骨橋蛋白，是一種細(xì)胞外基質(zhì)趨化因子樣磷酸糖蛋白，與免疫調(diào)節(jié)，腫瘤發(fā)生和細(xì)胞信號傳導(dǎo)相關(guān)[16]，有研究發(fā)現(xiàn)Spp1的上調(diào)可激活NF-κB信號通路促進(jìn)癌癥進(jìn)展[17]。Aldh1a2屬于醛脫氫酶1家族，參與腎臟發(fā)育過程中內(nèi)源性全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)的合成[18]。作為一種維生素A的活性代謝產(chǎn)物，ATRA在細(xì)胞增殖，分化以及凋亡中均起著重要作用[19]。Serpine1為1型纖溶酶原激活物抑制劑，許多研究指出其在癌癥中存在異常表達(dá)，如口腔鱗狀細(xì)胞癌，食道癌，膀胱癌等[20]。Tnc是一種大分子細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)糖蛋白，在胚胎發(fā)育過程中高度表達(dá)[21]。它能夠與ECM結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞表面受體(如EGFR、整聯(lián)蛋白)結(jié)合，激活下游途徑，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附，擴(kuò)散，遷移和增殖，研究顯示Tnc是促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的主要成分，在腎纖維化中起著關(guān)鍵作用[22]。但在急性腎損傷期，Tnc亦可被誘導(dǎo)，進(jìn)而增強Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，以起到保護(hù)腎臟的作用[23]。上述基因與AAI腎毒性相關(guān)報道不多。

AAI腎毒性差異表達(dá)的基因主要在小分子代謝過程、胞外間質(zhì)組織以及中性粒細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答等GO分類中顯著富集。KEGG分析表明差異表達(dá)基因在JAK-STAT、NF-κB信號通路；過氧化反應(yīng)；糖酵解/糖異生；胰島素抵抗；纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸降解等途徑中富集明顯。由此提示AAI導(dǎo)致的腎毒性可能與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、糖代謝等途徑相關(guān)。

鑒于AAI對腎臟具有明顯的毒副作用，臨床上在使用青木香、朱砂蓮、尋骨風(fēng)[24]等含馬兜鈴酸中藥的過程中應(yīng)注意監(jiān)測腎功能；同時，轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示的AAI腎毒性的基因及相關(guān)信號通路，可能為AAI腎毒性提供一定的治療思路。