張睿胤，成 鳳，鄭亞杰，陳 鵬，陸 英，袁建華，李先信*，唐 其*

1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，長沙 410128；2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，長沙 410125；3長沙和茂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，寧鄉(xiāng) 410609

枳殼(Aurantii Fructus)為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的未成熟果實[1]，其性溫，主治胸膈痞滿，脅肋脹痛，有理氣寬胸、行滯消積的功效[2,3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枳殼具有調(diào)節(jié)胃腸功能、利膽排石、降血脂和抗腫瘤等藥理作用[4]。枳殼中含有多種化學(xué)成分，如黃酮類、揮發(fā)性成分、生物堿類等。枳殼揮發(fā)性成分具有理氣、行滯、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌等作用[5,6]，是其理氣作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[7]；芳樟醇、檸檬烯等物質(zhì)是枳殼果香氣味的主要來源，被廣泛應(yīng)用于食品、日化等領(lǐng)域[8]。酸橙在7月果皮尚綠時采收，對酸橙而言人們研究利用主要集中在其果實中的黃酮類成分，但酸橙果實中還富含檸檬烯、芳樟醇等揮發(fā)性成分[8]；對酸橙不同部位的研究也相對較少，莖、葉等非藥用部位還需進一步地研究開發(fā)利用。若能對酸橙中揮發(fā)性成分進行系統(tǒng)性的檢測分析，建立一個簡單、快速的揮發(fā)性成分檢測方法，將會對酸橙的多樣化利用提供新的思路。

頂空固相微萃取(HS-SPME-GC-MS)技術(shù)如今已逐步應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、臨床化學(xué)、生物化學(xué)、法醫(yī)學(xué)等，具有快速、高效、靈敏、無污染等特點。在植物揮發(fā)性成分檢測中已經(jīng)在川芎、迎春、石韋、黃花菜等物種得以成功應(yīng)用[9-12]，甚至成功用于含有復(fù)雜揮發(fā)性成分的中成藥漢森四磨湯的揮發(fā)性成分檢測分析[13]，但總體而言對于中藥材的應(yīng)用尚不多見。

目前對酸橙成分的研究雖然有很多，但主要都是對其果實中黃酮類成分進行研究和利用，對揮發(fā)性成分相對較少；而酸橙果實中的揮發(fā)性成分又是其藥理藥效作用的關(guān)鍵組成部分；酸橙葉、莖等非藥用部位也具有明顯氣味，揮發(fā)性成分含量也較豐富，對酸橙生長發(fā)育具有重要意義。現(xiàn)階段對植物源揮發(fā)性成分的功能與效用已成為國內(nèi)外研究熱點，因此本實驗采用頂空固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，對不同時期酸橙果實中揮發(fā)性成分進行測定與分析，結(jié)合具體采收時間篩選出關(guān)鍵時期；對關(guān)鍵時期酸橙非藥用部位的根、莖、葉中揮發(fā)性成分進行檢測分析，研究不同部位間揮發(fā)性成分組成差異，為更好地開發(fā)利用酸橙資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，配有GC/MS solution色譜工作站和NIST.14、NIST.17質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫；固相微萃取裝置(上海安譜實驗科技有限公司)，包括固相微萃取手動進樣手柄、萃取纖維針頭(65 μm-PDMS/DVB、85 μm-Carboxen/PDMS、50/30 μm-DVB/Carboxen-PDMS、75 μm-Carboxen/PDMS)、頂空樣品瓶；YB-1500A型粉碎機(永康市速鋒工貿(mào)有限公司)；PL203電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；MM400混合型球磨儀(廣州艾威儀器科技有限公司)；Milli-Q Advantage A10超純水制備系統(tǒng)(美國MILLPORE公司)。

1.2 實驗樣品

實驗用藥材采于湖南省益陽市沅江市三眼塘鎮(zhèn)枳殼規(guī)范化種植基地，分別于2018年6月3日(CA-1)、6月11日(CA-2)、6月17日(CA-3)、7月1日(CA-4)、7月8日(CA-5)、7月21日(CA-6)、8月22日(CA-7)、9月22日(CA-8)這8個時期采集，每個時期采集三株樹作為生物學(xué)重復(fù)，編號如CA1-1、CA1-2、CA1-3，依此類推。后選取7月1日，采集酸橙的根(CA-R)、莖(CA-S)、葉(CA-L)、果(CA-F)。對照品D-檸檬烯、γ-松油烯、芳樟醇購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 方法

1.3.1 材料準(zhǔn)備及樣品前處理

烘干機溫度調(diào)至60 ℃烘干至恒重，使用球磨儀粉碎后并過60目篩，置于封口袋編號封口保存。取約0.2 g樣品，精密稱定，放置在頂空樣品瓶中，備用。

將對照品使用正己烷稀釋，D-檸檬烯、γ-松油烯、芳樟醇濃度依次為1.0、1.0、0.4 mg/mL；吸取各稀釋后的對照品溶液1 μL于同一頂空樣品瓶中，擰緊瓶蓋，備用。

1.3.2 萃取頭纖維老化

組裝萃取纖維針頭與萃取進樣手柄，隨后插入氣相色譜儀的氣化室SPL1處，推出萃取纖維針頭，設(shè)定氣化室溫度為240 ℃，40 min后縮回萃取纖維針頭，取出萃取進樣手柄，完成纖維頭老化。

1.3.3 萃取方法

固相微萃取裝置溫度為70 ℃，將裝有樣品的萃取瓶置于固定在裝置中預(yù)熱40 min，再將萃取進樣手柄插入萃取瓶中，40 min后將萃取手柄取出。

1.3.4 GC-MS測試條件

色譜柱為HP-88(100 m × 0.25 mm，0.25 μm，安捷倫公司)；進樣口溫度240 ℃；載氣高純氦氣(含有量99.99%)；柱流量為0.98 mL/min；分流比5∶1；程序升溫：初始柱溫60 ℃，保持5 min,以3 ℃/min升到138 ℃，保持2 min，再以3 ℃/min升到140 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升到210 ℃，保持10 min，最后以5 ℃/min升到240 ℃，保持10 min。

接口溫度：220 ℃ ；離子源：EI 源；離子源溫度：200 ℃，電子能量：70 eV；質(zhì)何比掃描范圍：45～500m/z；質(zhì)譜圖采用NIST.17、NIST.14譜庫檢索比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取纖維頭的優(yōu)化

固相微萃取纖維頭的不同顏色代表了不同的吸附膜種類，對揮發(fā)性成分的吸附能力存在較大差異。通過比較對酸橙根、莖、葉、果混合樣品中揮發(fā)性成分的吸附能力，篩選出適合酸橙混合樣品中揮發(fā)性成分的萃取纖維頭。本研究選取50/30 μm-DVB/Carboxen-PDMS灰色纖維頭用于實驗。

2.2 揮發(fā)性成分分析

通過氣相色譜-質(zhì)譜對酸橙樣品進行測定，利用GC-MS solution軟件中的NIST.14、NIST.17標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索色譜圖中存在的可能化合物，結(jié)合人工圖譜解析和文獻資料進行進一步定性分析，推測化合物的可能結(jié)構(gòu)；再通過比對對照品成分的出峰時間，對相關(guān)化合物進行進一步的確認(rèn)。采用峰面積歸一化法計算各成分相對含量；使用 Microsoft Excel 2019、SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行整理與統(tǒng)計(見圖1、圖2、表1)。通過比對標(biāo)準(zhǔn)品溶液、結(jié)合文獻及NIST.17、NIST.14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，對化合物種類進行了初步鑒定。采用面積歸一法計算各個積分的色譜峰占總峰面積百分比，分析揮發(fā)性成分的相對含量。

表1 酸橙果實不同時期揮發(fā)性成分組成

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖1 不同時期酸橙果實GC-MS總離子流圖

圖2 酸橙不同部位GC-MS 總離子流圖

由結(jié)果可知，8個時期酸橙果實樣品共檢測揮發(fā)性成分69種；其中6月3日樣品共檢測出44種揮發(fā)性成分；6月11日樣品共檢測出37種化學(xué)成分；6月17日樣品共檢測出39 種化學(xué)成分；7月1日樣品共檢測出43種化學(xué)成分；7月8日樣品共檢測出45種化學(xué)成分；7月21日樣品共檢測出46種化學(xué)成分；8月22日樣品共檢測出46種化學(xué)成分；9月22日樣品共檢測出40種化學(xué)成分。D-檸檬烯、芳樟醇是其主要共有成分。對酸橙的不同部位(根、莖、葉、果)干燥樣品進行揮發(fā)性成分測定，共鑒定出64種化合物，包括萜烯類(18種)、酮類(9種)、萜烯醇類(8種)、醛類(6種)化合物等，且不同部位揮發(fā)性成分的組成與含量差異較大(見圖3、圖6)。不同部位酸橙揮發(fā)性化學(xué)成分組成存在差異(見圖3、圖4)，萜烯類、萜烯醇類化合物是四個部位的主要成分；根、莖中烷烴與烯烴類化合物相對含量(17.64%、16.67)高于葉、果(9.52%、8.57%)；葉中酮類化合物顯著高于其他三個部位(16.67%)；果實中主要以萜烯類、萜烯醇類化合物為主，二者相對含量超過 60%。酸橙不同部位中共有成分有19種(見圖4)。根中特有成分有10種，主要以烷烴、烯烴為主；莖中特有成分有9種，氧化物成分相對較多；葉中特有成分有11種，且在葉中檢測到醚類化合物；葉和果實中檢測出香芹酚、百里酚等酚類化合物。

圖3 不同部位酸橙揮發(fā)性成分種類差異圖

圖4 不同部位酸橙揮發(fā)性成分Venn圖

8個時期酸橙果實樣品中，D-檸檬烯、γ-松油烯、芳樟醇三種成分相對含量存有較大差異；D-檸檬烯為8個時期樣品中相對含量最高的物質(zhì)；三種成分總相對含量在6月17日、7月1日兩個時期相對含量較高(分別為38.03%、33.95%)。三種成分總量整體而言呈現(xiàn)先上升再下降的變化趨勢，在6月中旬到7月初這段時期達到頂點(見圖5)；D-檸檬烯相對含量在6月初到6月中旬呈現(xiàn)上升趨勢，隨后在7月初開始逐漸下降，直至7月下旬；從7月下旬到8月下旬又開始小幅上升；8月下旬到9月下旬又開始呈現(xiàn)下降趨勢。芳樟醇相對含量從6月初開始逐步上升，在7月初達到頂點；隨后逐漸下降。相對而言，γ-松油烯的相對含量變化幅度較小，但仍有先上升后下降的變化趨勢。

圖5 三種成分相對含量變化趨勢

根據(jù)分析結(jié)果來看(見圖6)，D-檸檬烯和芳樟醇主要集中在酸橙葉、果部位；芳樟醇在酸橙莖中也有較高含量(8.92%)，推測主要因植物不同器官生理代謝功能不同，從而使其釋放的揮發(fā)性成分組成產(chǎn)生較大差異；酸橙葉、果氣味明顯，芳樟醇、檸檬烯、羅勒烯等萜類化合物是其果香、清香的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖6 不同部位酸橙兩種揮發(fā)性成分含量差異

將整理好的酸橙果實不同時期數(shù)據(jù)文件分別進行層聚類分析(HCA)，如圖7所示，八個時期的酸橙果實樣品被劃分為三大組，6月3日、6月17日、6月21日為第一大組；7月1日、7月8日、7月21日為第二大組；8月22日、9月22日為第三大組，表明酸橙果實不同時期樣品揮發(fā)性化學(xué)成分組成變化較為明顯；樣品中揮發(fā)性成分含量的變化趨勢也出現(xiàn)集群現(xiàn)象，可明顯劃分出明顯的上升(紅色)、下降(藍色)區(qū)域；其中第一大組中萜烯醇類化合物含量較高；第二大組化萜烯類化合物含量較高；第三大組化合物主要以酯類、烯烴類化合物為主；隨著生長期的增長，酸橙果實中揮發(fā)性成分從醇類、萜烯類化合物逐步轉(zhuǎn)變?yōu)轷ヮ悺⑾N類。同時發(fā)現(xiàn)三個異常組分，即圖中1-3、3-1、6-3三個樣品，因植物源揮發(fā)性成分含量變化受外界因素影響較大，如溫度、脅迫、光照、CO2體積分?jǐn)?shù)等，這些因素均會導(dǎo)致不同生物學(xué)重復(fù)樣品中揮發(fā)性成分組成、含量上的差異。故其含量與同時期其他兩組重復(fù)樣品產(chǎn)生差異的原因推測為不同生物學(xué)重復(fù)的差異。

繼續(xù)利用主成分分析(PCA)對上述各處理組數(shù)據(jù)進一步分析(見圖8)。數(shù)據(jù)經(jīng)主成分分析共提取了五個主成分，它們的方差貢獻依次為第一主成分(70.4%)、第二主成分(13.1%)、第三主成分(6%)、第四主成分(3%)和第五主成分(2.1%)，其中主成分一、二和為83.5%，所以選取主成分一二基本能涵蓋樣品的大部分成分信息。分別以主成分一和二做PCA得分圖，如圖7所示，明顯看出各樣品組內(nèi)呈現(xiàn)出很好的聚集趨勢，酸橙果實不同時期樣品存在著較明顯的組間差異，表明酸橙果實不同時期揮發(fā)性化學(xué)成分發(fā)生顯著變化。其中6月初至6月底三個時期的樣品為一大組，7月初至9月底五個時期的樣品為一大組，成分差異明顯。

圖7 不同時期酸橙揮發(fā)性成分聚類熱圖

圖8 不同時期酸橙揮發(fā)性成分PCA得分圖

3 討論與結(jié)論

酸橙果實中化學(xué)成分豐富，種類繁多，其中揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿類是其藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。酸橙果實揮發(fā)性成分主要為單萜化合物及單萜的含氧衍生物，目前測定出的揮發(fā)性成分已經(jīng)有50多種，如檸檬烯、芳樟醇、α-蒎烯、β-蒎烯等[15]，大多數(shù)酸橙中揮發(fā)油的主要成分為檸檬烯和芳樟醇[16-19]；不同產(chǎn)地的酸橙含有揮發(fā)油的主要成分不同,此外也與后續(xù)的炮制工藝等因素有較大關(guān)聯(lián)。檸檬烯是酸橙果實含量最高的揮發(fā)油成分，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗菌和溶膽結(jié)石等生理活性[18]。通過其藥理分析認(rèn)為檸檬烯是其飲片枳殼、枳實具有理氣作用的組成成分[20]。芳樟醇也是酸橙果實揮發(fā)性成分的重要成分之一，為鏈狀單萜，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日化等各類領(lǐng)域[8]，是合成維生素E、A的重要中間體；另外具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗氧化等作用[19,20]，且天然芳樟醇因具有旋光性，從而更具有醫(yī)學(xué)價值。同時發(fā)現(xiàn)除酸橙果實外，酸橙莖、葉中有效揮發(fā)性成分含量也有著較高水平，如芳樟醇在酸橙葉樣品中的相對含量超過了24%，在酸橙莖樣品中的相對含量超過了8%；酸橙莖中欖香醇(23.98%)、百里酚(17.29%)也有著較高的相對含量，二者在葉樣品中相對含量也較高(23.49%、10.35%)。課題組前期采用 UHPLC-ESI-Q-TOF/MS 對酸橙不同部位進行了植物化學(xué)成分及主要活性成分含量測定，6 月中下旬至 7 月初采收的酸橙果實表現(xiàn)出極強的抗氧化能力，并且發(fā)現(xiàn)酸橙葉和莖提取物也顯示出一定程度的潛在抗氧化活性[21]。

現(xiàn)階段而言，人們對酸橙根、莖、葉中的有效成分進行分析研究相對較少。傳統(tǒng)的酸橙采收方式主要以果實采收為主，其根、莖、葉在采收過程中并未得到開發(fā)利用，但這些非藥用部位生物產(chǎn)量多，具有豐富的藥效成分，開發(fā)利用前景較大。許多揮發(fā)性成分還具有促進種子傳播、植物間相互作用、抗脅迫等功能，對環(huán)境、植物自身及人類生存具有重要意義；利用代謝組檢測結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，從分子水平闡明植物揮發(fā)性成分的生物合成途徑，已成為植物源揮發(fā)性成分研究熱點。

本次實驗運用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)測定酸橙不同時期果實、不同部位中揮發(fā)性成分，闡明其關(guān)鍵成分相對含量的時期變化規(guī)律及不同部位間組成差異，為對酸橙中揮發(fā)性成分的進一步開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)參考；同時建立了基于頂空固相微萃取技術(shù)的揮發(fā)性成分檢測方法，具有快速、高效、靈敏等特點，可以較真實地反映樣品中揮發(fā)性成分組成，也為檢測鑒定酸橙揮發(fā)性成分提供了新的技術(shù)思路，為進一步開發(fā)利用酸橙非藥用部位提供了數(shù)據(jù)和技術(shù)參考。