馮犖犖，王 銳，董兆斌，廖玉美，王國(guó)良，張潤(rùn)光，張有林*

1陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119；2陜西省林業(yè)技術(shù)推廣總站，西安 710082；3陜西省商洛盛大實(shí)業(yè)股份有限公司，商洛 726000；4陜西省城固縣農(nóng)業(yè)機(jī)械管理站，漢中 723200

歐李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.)為薔薇科櫻桃屬落葉小灌木，主要分布在黑龍江、吉林、遼寧等省區(qū)，是我國(guó)大西北干旱區(qū)域造林的先鋒樹種，也是我國(guó)的特有果樹[1]。歐李果實(shí)鮮紅飽滿，果肉具特殊香氣，含鈣量極高，被譽(yù)為“鈣果”，是天然鈣素來(lái)源和保健水果，也是“第三代功能水果”之一[2]。歐李果實(shí)富含多種糖類、有機(jī)酸、氨基酸、維生素及礦質(zhì)元素，是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水果[3]。歐李種仁為藥食同源的中藥材郁李仁[4]。多糖是一類大分子聚合物，具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗腫瘤[6]、抗癌、抗菌、抗氧化等多種藥理活性。近年來(lái)用歐李果實(shí)深加工研發(fā)的產(chǎn)品有歐李果汁[7]、果脯[8]、果酒等，但關(guān)于對(duì)歐李多糖的研究鮮有報(bào)道。本文以陜西榆林沙地栽培的歐李為原料，對(duì)其多糖制備、結(jié)構(gòu)特征及其免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行研究，旨在為我國(guó)歐李資源開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐李果實(shí)(陜西省榆林市沙漠研究所，果實(shí)完熟，批號(hào)：202002)；RAW 264.7巨噬細(xì)胞(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)：20200822)；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖均為標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：C11M10H82342、Y27M11C114179、O12A10K95105、R09J11H115178、S12J10I90131、080M00143V、Z22J9H64187、B02M6 W1、Z01J9H62701、F05D9Y75981)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，批號(hào)AF29494674)；NO試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：011020200903)；TNF-α、IL-6、IFN-β試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：202101)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；LGJ-25C真空冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)；Multiskan Go型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電公司)；UV300型紫外分光光度計(jì)(上海儀邁儀器科技有限公司)；1260Ⅱ型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)；ELEOS System凝膠色譜儀(美國(guó)懷雅特技術(shù)公司)；傅里葉紅外變換光譜儀(德國(guó)布魯克公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 歐李多糖的提取

采用傳統(tǒng)的水提醇沉法。將歐李鮮果去核曬干粉碎，過0.25 mm孔徑篩，得歐李干粉。稱取歐李干粉20.0 g，加入適量95%乙醇浸泡，去除果粉中多余的還原糖與雜質(zhì)，過濾后濾渣加適量蒸餾水，用不同溫度的熱水浸提一段時(shí)間，提取液真空抽濾，循環(huán)提取3次，合并3次提取液，減壓濃縮至原體積1/4，然后緩慢加入4倍體積的95%乙醇，充分混勻，放置于4 ℃冰箱沉淀24 h，離心取沉淀物，加入100 mL蒸餾水，旋蒸去除乙醇，得到歐李粗多糖溶液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以蒸餾水為提取溶劑，液料比20∶1(mL/g)，提取時(shí)間2.0 h，設(shè)置提取溫度分別為60、70、80、90、100 ℃，考察提取溫度對(duì)歐李多糖得率的影響；以液料比20∶1(mL/g)，提取溫度80 ℃，設(shè)置提取時(shí)間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，考察提取時(shí)間對(duì)歐李多糖得率的影響；以提取時(shí)間2.0 h，提取溫度80 ℃，設(shè)置液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)，考察液料比對(duì)歐李多糖得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

選取提取溫度X1、提取時(shí)間X2、液料比X3三個(gè)因素，以歐李多糖得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法，得到二次回歸方程，并找出最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.4 歐李多糖得率的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[9]。準(zhǔn)確稱取適量的葡萄糖，分別配制成濃度為0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。各吸取1.0 mL溶液，加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL濃硫酸，搖晃均勻，30 ℃水浴反應(yīng)20 min。冷卻后在490 nm波長(zhǎng)下用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=6.137 3x+0.122 4，R2=0.999 7。

取1.0 mL歐李多糖溶液，加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL濃硫酸，30 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻后在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出多糖濃度。再用公式計(jì)算歐李多糖得率(以干粉計(jì))。

式中，c：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測(cè)定液中多糖的濃度，單位為mg/mL；V：樣品定容體積，單位為mL；m：樣品質(zhì)量，單位為g；n：稀釋倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。

1.3.5 歐李多糖的分離純化

1.3.5.1 蛋白質(zhì)、色素脫除

在歐李粗多糖溶液中加入約1/4體積的Sevage試劑(正丁醇∶氯仿=1∶4)，去除沉淀，反復(fù)操作約10次，直至蛋白質(zhì)去除完全。用D-101大孔樹脂脫色6 h，并用5 000 Da截留量的透析袋透析48 h，去除小分子雜質(zhì)，冷凍干燥，得到較高純度的歐李多糖(Cerasushumilispolysaccharide，CHP)。

1.3.5.2 DEAE-52纖維素柱層析

用蒸餾水以1 mL/min流速將DEAE-52纖維素層析柱(2.6 mm×30 cm)平衡12 h，稱取適量歐李多糖，充分溶解在蒸餾水中，離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，然后上樣，用0、0.1、0.2、0.3、0.5 mol/L氯化鈉溶液梯度洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集5 mL，采用苯酚-硫酸法測(cè)定洗脫液中多糖含量，以收集管號(hào)為橫坐標(biāo)，每管洗脫液吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。合并單個(gè)洗脫峰的收集液，濃縮、透析、凍干，得到兩個(gè)主要組分，分別命名為CHPP-1和CHPP-2。

1.3.5.3 G-100葡聚糖凝膠柱層析

將DEAE-52纖維素柱層析中收集到的0.1、0.2 mol/L NaCl洗脫組分分別用G-100葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)一步純化。分別取20 mg DEAE-52纖維素柱層析后的歐李多糖樣品，溶于5.0 mL蒸餾水，溶解完全后離心，取上清液純化，蒸餾水為洗脫劑，洗脫速度0.3 mL/min，每5 min收集1管，測(cè)定洗脫液中多糖含量，以收集管號(hào)為橫坐標(biāo)，每管洗脫液吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，收集主峰的洗脫液，濃縮、透析、凍干，備用。

1.3.5.4 紫外光譜分析

準(zhǔn)確稱取CHPP-1、CHPP-2各10 mg，蒸餾水定容10 mL，得到濃度1 mg/mL的歐李多糖水溶液，以蒸餾水作空白，以200～900 nm為掃描范圍，全波長(zhǎng)掃描。

1.3.6 歐李多糖單糖組成分析和分子量測(cè)定

用PMP衍生化單糖，具體操作參考文獻(xiàn)，略有修改[10]。分別取適量CHPP-1、CHPP-2于水解管中，加入4 mol/L三氟乙酸1 mL，于120 ℃烘箱中水解2 h。取出后氮?dú)獯蹈?；向吹干后的樣品中?mL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液以及0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，70 ℃水浴60 min，冷卻，加0.5 mL 0.3 mol/L HCl溶液和0.5 mL氯仿，振蕩搖勻，靜置20 min，棄去下層，萃取三次，取水層過膜上機(jī)。

高效液相色譜測(cè)定單糖色譜條件：流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，柱溫25 ℃，洗脫液：流動(dòng)相A(0.1 mol/L磷酸二氫鉀，pH 6.8)∶流動(dòng)相B(乙腈)=82∶18。色譜柱：SHISEIDO C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

分子量測(cè)定采用凝膠滲透色譜儀，具體操作參考文獻(xiàn)，略有修改[11]。分別精準(zhǔn)稱取CHPP-1、CHPP-2適量，溶于0.02% NaN3溶液，進(jìn)樣分析。將Shodex OHpak色譜柱接入ELEOS System凝膠色譜儀，采用Waters 515泵激光檢測(cè)器分離檢測(cè)，數(shù)據(jù)由ARTRAV軟件自動(dòng)處理。色譜條件：流動(dòng)相水+0.02% NaN3，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量500 μL。

1.3.7 歐李多糖的紅外光譜分析

分別稱取一定質(zhì)量的CHPP-1、CHPP-2，加入適量的KBr研磨混勻壓片，以KBr為掃描背景，利用紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍掃描。

1.3.8 CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖影響試驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇后的RAW 264.7接入含10%胎牛血清的DEME高糖完全培養(yǎng)液中，于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)。

采用MTT試驗(yàn)法檢測(cè)CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，使細(xì)胞繁殖到5×105個(gè)/mL，將200 μL細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育24 h，棄去上層清液。每孔加入100 μL不同濃度的CHPP-2(20、40、80、160、320、640 μg/mL)；陽(yáng)性對(duì)照組加入100 μL含有LPS(1 μg/mL)的培養(yǎng)液；空白對(duì)照組(control，CT)加入等體積的培養(yǎng)液，每組四個(gè)重復(fù)。邊緣孔用PBS填充，避免細(xì)胞上清液蒸發(fā)。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，每孔避光加入10 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除原有培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜溶液，震蕩混合均勻，以充分溶解紫色的甲瓚結(jié)晶。10 min后，在570 nm處使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光值。

1.3.9 CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌NO和細(xì)胞因子影響試驗(yàn)

RAW 264.7細(xì)胞接種于24孔板中，使每孔細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，在二氧化碳培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)孵育。24 h后倒掉培養(yǎng)液，在24孔板中加入不同濃度的CHPP-2(20、40、80、160、320、640 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以LPS(1 μg/mL)作陽(yáng)性對(duì)照。孵育結(jié)束后，用NO試劑盒測(cè)定NO含量，用Elisa試劑盒測(cè)定上清液中TNF-α、IL-6、INF-β含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019b軟件作圖，利用DPS軟件方差分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)歐李多糖得率的影響

由圖1A看出，提取溫度在60～80 ℃之間，隨溫度升高歐李多糖得率顯著提高(P<0.05)。80 ℃時(shí)得率最高，為30.99%，隨后隨著提取溫度升高，多糖得率顯著下降。結(jié)果表明，在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度升高，歐李多糖在萃取體系中的傳遞阻力減小，溶解度增大。但過高溫度會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致歐李多糖降解[12]，最佳提取溫度為80 ℃。由圖1B看出，在1～2 h范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，歐李多糖得率略有增加(P>0.05)，2 h達(dá)到最高，為26.92%。2 h后有所下降，2 h為最佳提取時(shí)間。由圖1C看出，液料比從10∶1(mL/g)增加到15∶1(mL/g)，歐李多糖得率顯著提高(P<0.05)，當(dāng)液料比為15∶1(mL/g)時(shí)，達(dá)到28.05%，隨著液料比繼續(xù)增大，多糖得率基本不變，最佳液料比為15∶1(mL/g)。

圖1 提取溫度、提取時(shí)間、液料比對(duì)歐李多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)所得的試驗(yàn)結(jié)果使用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行分析，得到回歸方程如下：

Y=32.51-0.095X1-0.24X2+1.13X3+0.27X1X2-1.19X1X3-0.51X2X3-1.75X12-2.24X22-2.99X32。式中X1是提取溫度，X2是提取時(shí)間，X3是液料比。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2、表3。由表2、表3看出，回歸模型具有高度顯著性(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)具有不顯著性(P=0.150 1>0.05)，回歸模型可靠?；貧w方程各項(xiàng)方差分析表明，因素X3對(duì)歐李多糖得率有極顯著影響(P<0.01)，X12對(duì)歐李多糖得率有顯著影響(P<0.05)，X22、X32對(duì)歐李多糖得率有極顯著影響(P<0.000 1)，因子X1X2、X2X3對(duì)歐李多糖得率影響不顯著(P>0.05)，因子X1X3對(duì)歐李多糖得率影響極顯著(P<0.01)。各因素對(duì)歐李多糖得率的影響依次是X3(液料比)>X2(提取時(shí)間)>X1(提取溫度)。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

續(xù)表3(Continued Tab.3)

對(duì)二次響應(yīng)方程方差分析結(jié)果做響應(yīng)面圖(見圖2)。由二次多項(xiàng)式方程得到歐李多糖的最佳提取條件為：提取溫度78.93 ℃，提取時(shí)間1.96 h，液料比16.08∶1(mL/g)，在此提取條件下，預(yù)測(cè)歐李干粉多糖得率為32.65%。根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)整提取溫度為79 ℃，提取時(shí)間為2 h，液料比為16∶1(mL/g)，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，歐李干粉多糖得率為(32.18±0.08)%(n=3)，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖2 各因素及交互作用對(duì)歐李多糖得率的響應(yīng)面圖

2.3 歐李多糖分離純化結(jié)果

用濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，得到三個(gè)單一洗脫峰(見圖3A)。其中0.1、0.2 mol/L NaCl 溶液為主要洗脫峰，對(duì)其進(jìn)行G-100 葡聚糖凝膠柱層析，均得到一個(gè)洗脫峰，分別命名為CHPP-1、CHPP-2(見圖3B、3C)。將其分別收集洗脫液、透析、冷凍干燥備用。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)得CHPP-1、CHPP-2中多糖含量分別為99.16%和99.33%。此外，對(duì)CHP、CHPP-1、CHPP-2用紫外光譜全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見圖4，CHPP-1和CHPP-2在250～300 nm之間無(wú)吸收峰，說(shuō)明CHPP-1、CHPP-2均不含核酸和蛋白質(zhì)。

圖3 歐李多糖的純化洗脫曲線

圖4 CHP、CHPP-1、CHPP-2組分的紫外光譜圖

2.4 歐李多糖的單糖組成和分子量測(cè)定

用單糖標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照，用高效液相色譜法測(cè)定歐李多糖的單糖組成，結(jié)果見圖5。由圖5看出，CHPP-1由十種單糖組成，其相應(yīng)摩爾占比依次為：甘露糖(1.35%)、核糖(0.11%)、鼠李糖(4.58%)、葡萄糖醛酸(0.10%)、半乳糖醛酸(20.29%)、葡萄糖(1.75%)、半乳糖(17.36%)、木糖(2.71%)、阿拉伯糖(51.40%)、巖藻糖(0.35%)；CHPP-2由九種單糖組成，其相應(yīng)摩爾占比依次為：甘露糖(0.62%)、鼠李糖(5.68%)、葡萄糖醛酸(0.07%)、半乳糖醛酸(28.24%)、葡萄糖(9.72%)、半乳糖(11.68%)、木糖(1.07%)、阿拉伯糖(41.81%)、巖藻糖(1.11%)(見表4)。結(jié)果可知，歐李多糖組分CHPP-1和CHPP-2均主要由阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖三種單糖組成。采用凝膠滲透色譜儀測(cè)定歐李多糖的分子量，其中CHPP-1組分的分子量為47.26 kDa，CHPP-2組分的分子量為22.94 kDa。

圖5 10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和歐李多糖的HPLC譜圖

表4 CHPP-1、CHPP-2的單糖組成及摩爾占比

2.5 歐李多糖的紅外光譜掃描結(jié)果

CHP、CHPP-1、CHPP-2的紅外光譜掃描結(jié)果見圖6。由圖6可知3 442.46 cm-1附近寬而強(qiáng)的吸收峰屬于O-H伸縮振動(dòng)[13]。在2 794.05 cm-1附近的吸收峰則是由糖烷基的C-H伸縮振動(dòng)引起[14]。C=O的強(qiáng)峰出現(xiàn)在1 593.12 cm-1，說(shuō)明存在羧基[15]。1 366.97 cm-1處的吸收峰代表了C-H的角彎曲[16]。900～1 200 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰為C-O-C拉伸振動(dòng)和C-O-H彎曲振動(dòng)峰[17]。三個(gè)組分在786.95 cm-1處均出現(xiàn)吸收峰，表明三者均含有α-糖苷鍵[18]。

圖6 CHP、CHPP-1、CHPP-2組分的紅外光譜圖

2.6 CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響

由圖7看出，正常狀況下，細(xì)胞呈圓球形，體積小。不同濃度CHPP-2(20～640 μg/mL)作用于細(xì)胞24 h后，其體積增大。同時(shí)，細(xì)胞的密度也呈增大的趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞具有一定的活化作用，由此可推測(cè)CHPP-2具有潛在的免疫調(diào)節(jié)活性。CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響見圖8，由圖8看出，CHPP-2在20～640 μg/mL濃度范圍內(nèi)，均能顯著提高巨噬細(xì)胞的增殖活性，且有劑量依賴關(guān)系，說(shuō)明CHPP-2濃度對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)毒性。

圖7 CHPP-2對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

圖8 不同濃度CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響

2.7 CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌NO及TNF-α、IL-6、IFN-β的影響

NO在機(jī)體很多組織中調(diào)節(jié)多種生理過程，檢測(cè)在多糖刺激下巨噬細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽濃度即可判斷NO的產(chǎn)生量[19]。將不同濃度梯度的CHPP-2溶液加入細(xì)胞24 h后，取上清液測(cè)定NO含量，結(jié)果見圖9A。由圖9A看出，細(xì)胞在不同濃度(20～640 μg/mL)CHPP-2的作用下培養(yǎng)24h后，與CT組相比，NO釋放量增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。隨著溶液濃度的增加，細(xì)胞NO釋放量呈上升趨勢(shì)，且具有一定的劑量依賴性。試驗(yàn)結(jié)果表明，CHPP-2能夠激活RAW 264.7細(xì)胞，促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞分泌NO。

TNF-α、IL-6、IFN-β細(xì)胞因子含量在衡量免疫調(diào)節(jié)作用中起著重要作用。用不同濃度梯度CHPP-2加入細(xì)胞24 h后，取上清液，參照Elisa試劑盒說(shuō)明書測(cè)定TNF-α、IL-6、IFN-β含量，結(jié)果見圖9B、圖9C和圖9D。結(jié)果表明，與CT組比較，高、中、低劑量CHPP-2呈劑量依賴關(guān)系促進(jìn)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IFN-β，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。CHPP-2能激活RAW 264.7細(xì)胞，促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞分泌及釋放TNF-α、IL-6、IFN-β。

圖9 不同濃度CHPP-2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌NO及TNF-α、IL-6、IFN-β的影響

3 討論與結(jié)論

巨噬細(xì)胞是評(píng)估生物活性成分免疫調(diào)節(jié)功能的重要載體。巨噬細(xì)胞通過分泌多種細(xì)胞因子如一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、干擾素-β(IFN-β)、白介素-1(IL-1)等來(lái)發(fā)揮其免疫功能。植物多糖通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌量來(lái)調(diào)節(jié)其免疫功能。NO作為重要的信號(hào)分子介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)功能，有助于殺死腫瘤細(xì)胞和病原微生物[20]。TNF-α可由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能直接參與維護(hù)免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)，包括炎癥、分化、脂質(zhì)代謝和凋亡等[21]。有關(guān)研究表明，IL-6可由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，被認(rèn)為是在誘導(dǎo)急性期蛋白反應(yīng)期間與發(fā)熱有關(guān)的最重要的免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)[22]。IFN-β參與抗病毒免疫，減少T細(xì)胞增生，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟及活化，抑制B細(xì)胞和T細(xì)胞凋亡[23]。這些細(xì)胞因子主要是免疫細(xì)胞分泌的一些小分子蛋白質(zhì)，在機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Yao等[19]研究發(fā)現(xiàn)綠豆多糖顯著增加了巨噬細(xì)胞中NO、TNF-α和IL-6的釋放。Du等[21]研究發(fā)現(xiàn)無(wú)花果多糖可以顯著促進(jìn)細(xì)胞毒性分子(NO)和細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)的分泌以及RAW 264.7巨噬細(xì)胞的吞噬作用。Ren等[24]研究了沙蒿籽多糖對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)沙蒿籽多糖能顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞中NO、TNF-α、IL-6和IFN-β的分泌。這與本實(shí)驗(yàn)得出的歐李多糖能顯著促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞中NO、TNF-α、IL-6及IFN-β細(xì)胞因子釋放的結(jié)果相一致，表明歐李多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性。

采用水提醇沉法提取歐李多糖，得到最佳提取工藝條件為提取溫度79 ℃，提取時(shí)間2 h，液料比16∶1(mL/g)，歐李干粉多糖得率為(32.18±0.08)%。CHPP-1、CHPP-2中多糖含量分別為99.16%和99.33%。CHPP-1的主要單糖組成及摩爾比為阿拉伯糖∶半乳糖醛酸∶半乳糖=51.4∶20.29∶17.36，分子量為47.26 kDa。CHPP-2的主要單糖組成及摩爾比為阿拉伯糖∶半乳糖醛酸∶半乳糖=41.81∶28.24∶11.68，分子量為22.94 kDa。歐李多糖為吡喃環(huán)型多糖。CHPP-2在20～640 μg/mL濃度范圍內(nèi)能激活巨噬細(xì)胞，顯著促進(jìn)NO、TNF-α、IL-6及IFN-β細(xì)胞因子的釋放，且具有劑量依賴性，說(shuō)明歐李多糖有一定的免疫調(diào)節(jié)活性。