任婷月，李永強，王曉勇，韓 英，甄 攀

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術中心，山西汾陽 032205）

“曲為酒之骨”，大曲的質(zhì)量直接影響清香型白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。大曲作為釀酒的糖化發(fā)酵劑，在釀酒過程中起著糖化、發(fā)酵、生香的作用，直接或間接影響酒體的品質(zhì)和風格。清香型大曲是以大麥、豌豆為主要原料，采用自然接種，中溫發(fā)酵培養(yǎng)的一種粗酶復合制劑。大麥是清香型白酒大曲的主要原料，不同產(chǎn)地來源的大麥由于淀粉含量、蛋白質(zhì)含量、千粒重、發(fā)芽率、內(nèi)生菌等指標的不同，在一定程度上決定了它們制曲性能的不同，包括培曲過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替。目前，對于不同產(chǎn)地來源不同品種大麥理化特性及其制曲性能研究較少。

高通量測序技術可以對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全面的分析，可以快捷方便的讀取樣品中復雜的微生物結(jié)構(gòu)，具有明顯的先進性和優(yōu)勢，是分析復雜多菌種樣品的首選方法。目前，高通量測序技術已經(jīng)運用于各種分子生物學領域，包括人體微生物、水中微生物、土壤微生物群落研究等。相關大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究已有開展，李曉然等運用克隆文庫和焦磷酸測序?qū)Ψ诰拼笄魄蛢Υ骐A段的細菌和真菌多樣性進行了研究；楊旭等采用高通量技術解析了白酒中高溫大曲細菌與真菌群落結(jié)構(gòu)；關凱樂采用高通量測序技術對清香型白酒大曲和酒醅發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替進行了研究。但是不同產(chǎn)地來源的原料對于大曲發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律影響的相關研究非常少。

本研究采用高通量測序方法跟蹤不同產(chǎn)地來源大麥培曲發(fā)酵過程，對比分析大曲發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律的變化，旨在為清香型白酒制曲原料大麥的選擇與豐富提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

供試大麥：山西產(chǎn)地來源的冬性大麥品種，標記為SY，對照品種為甘肅產(chǎn)地來源的清香型白酒制曲大麥品種，標記為DZ。

山西冬性大麥與清香型白酒制曲大麥品種培曲發(fā)酵過程樣品：依據(jù)制曲工藝確定本研究取樣節(jié)點，選取大曲發(fā)酵天數(shù)0 d、2 d、4 d、9 d、13 d、18 d、24 d 作為取樣節(jié)點，試驗組與對照組分別標記為：SY0、SY2、SY4、SY9、SY13、SY18、SY24 和DZ0、DZ2、DZ4、DZ9、DZ18、DZ24。隨機抽取3 塊具有節(jié)點代表性的大曲，無菌袋封裝，放入冰盒內(nèi)，迅速帶回實驗室進行樣品處理。

試劑及耗材：2×Taq Plus Master Mix，Vazyme；Agencourt? AMPure? XP(核 酸 純 化 試 劑 盒)：Beckman Coulter；KAPA Library Quantification Kit(文庫定量試劑盒)，KAPA；MiSeq? Reagent Kit v3(600 cycle)(PE300)，illumina。

儀器設備：Eppendorf 高速臺式冷凍離心機，Eppendorf；電泳儀，Bio-Rad；ABI 9700 PCR 儀，ABI；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)，UVP Bioimaging System；Agilent 2100 生物分析儀，Agilent；Labchip GX生物大分子分析儀，PerkinElmer；ABI Qpcr儀，美國ABI；高通量二代測序儀，illumina。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

稱取實時采集的大曲樣品50 g 溶于450 mL 無菌水中，振蕩混勻，吸取菌懸液50 mL 于離心管中，4 ℃下以13000 r/min 高速離心20 min，棄上清液，液氮速凍；準備混合裂解液（800 μL 月桂酸鈉提取液+20 μL 溶菌酶+20 μL 溶壁酶）于2 mL 離心管，輕輕混勻，放置冰上；研缽以液氮預冷，將樣品置于研缽中，倒入液氮，迅速研磨至粉末級，期間定時加入液氮，防止研磨過程中樣品降解；將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移到混合裂解液2 mL 離心管中，置于渦旋振蕩儀15～20 min；用移液槍向2 mL 離心管中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），緩慢搖勻；4 ℃下以12000 r/min 離心10 min 后取出，吸取上清液于新滅菌的2 mL 抽提試管中；向上述離心管中加入10 μL RNAase，37 ℃下放置30 min；加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），4 ℃、12000 r/min 離心10 min；吸取上清液于新滅菌的1.5 mL抽提試管中；向上述抽提管中加入0.7倍體積異丙醇，上下緩慢顛倒數(shù)次，置于-20 ℃下30 min；4 ℃、12000 r/min 離心20 min；倒掉上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次，真空干燥；加入20 μL的雙蒸水（ddHO）溶解30 min；-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用Nano-Drop 2000 型超微量分光光度計測定其濃度和純度。

1.2.2 PCR擴增

利用細菌核糖體16S rRNA基因的V3—V4高變區(qū)進行擴增，建立克隆文庫測序，相關引物對為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。真核微生物擴增的序列為非編碼rRNA 的ITS2 區(qū)域，相關引物對為:ITS3(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。對不同節(jié)點樣品的通用引物進行特異性設計，加入含有特異的8 個堿基的序列標簽(barcode)進行區(qū)分。PCR 反應體系（總體系為25 μL）：12.5 μL 2xTaq Plus Master Mix、3 μL BSA（2 ng/μL）、1 μL Forward Primer(5 μM)、1 μL Reverse Primer(5 μM)、2 μL DNA（加入的DNA 總量為30 ng），最后加入5.5 μL dd HO 補足至25 μL。反應參數(shù)：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，28 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的條帶大小，并用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化。

1.2.3 MiSeq 測序

PCR 產(chǎn)物用于構(gòu)建微生物多樣性測序文庫，在北京奧維森基因科技有限公司使用Illumina Miseq PE300 高通量測序平臺進行Paired-end 測序。測序原始序列上傳至NCBI 的SRA數(shù)據(jù)庫。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析處理

下機數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME1（v1.8.0）軟件根據(jù)Barcode 序列拆分樣本，使用Pear（v0.9.6）軟件對數(shù)據(jù)進行過濾、拼接。去除打分值低于20，含有模糊堿基，引物錯配序列。拼接后使用Vsearch（v2.7.1）軟件去除長度小于230 bp 的序列，并根據(jù)Gold Database 數(shù)據(jù)庫用uchime 方法比對去除嵌合體序列。使用Vsearch（v2.7.1）軟件uparse 算法對優(yōu)質(zhì)序列進行OTU 聚類（Operational Taxonomic Units），序列相似性閾值為97 %。每個OUT 都有一個代表序列，將代表性序列與物種的使用RDP 數(shù)據(jù)庫進行比對，設置70%的置信度閾值，對每個代表性序列進行物種注釋。利用QIIME1（v1.8.0）軟件進行α多樣指數(shù)分析（包括Shannon、Simpson 和Chao1 等指數(shù)）?；谖锓N注釋及相對豐度結(jié)果，使用R（v3.6.0）軟件進行物種組成柱狀圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋性曲線

稀釋性曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本物種豐富度。采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU 的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此，通過作稀釋性曲線，可得出樣品的測序深度情況。試驗組與對照組大曲發(fā)酵樣品的稀釋性曲線見圖1 和圖2。由圖1 和圖2 可知，曲線最終趨勢都趨于平坦，說明此次測序深度能反映樣品中的物種信息。

圖1 細菌稀釋性曲線

圖2 真菌稀釋性曲線

2.2 Alpha多樣性分析

通過Alpha 多樣性分析可以知道微生物群落的豐富度和多樣性。Chao1 指菌種豐富度指數(shù)，用以估計群落中的OTU 數(shù)目，通常Chao1 指數(shù)越高，樣品中物種豐富度越大。Shannon（香農(nóng)指數(shù)）是用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，通常Shannon 指數(shù)值越大，表示樣本中物種多樣性越高，反之，樣品中的物種多樣性越低。由圖3可知，隨著大曲發(fā)酵的進行，試驗組與對照組的細菌多樣性均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，且在晾霉階段與養(yǎng)曲階段多樣性變化幅度較大，出房曲的Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)均最高，說明出房曲的細菌豐富度和多樣性最高。由圖4 可知，隨著大曲發(fā)酵的進行，試驗組與對照組的真菌多樣性均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，且在晾霉階段的Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)最高，說明該階段的真菌豐富度和多樣性最高。

圖3 細菌Alpha多樣性box圖

圖4 真菌Alpha多樣性box圖

2.3 細菌群落多樣性

基于屬水平，試驗組和對照組在大曲發(fā)酵過程中群落結(jié)構(gòu)的演替情況見圖5，相對豐度小于1 %的并為other。

由圖5 可知，在細菌屬水平上，上霉階段試驗組和對照組群落結(jié)構(gòu)有所差異。試驗組中，乳桿菌屬（）占絕對優(yōu)勢，占83 %；對照組中，乳桿菌屬（）占50.7 %、明串珠菌屬（）占17.3 %、擬桿菌屬（）占15.9 %、魏斯氏菌屬（）占3.8 %、歐文氏菌屬（）占3.5%。

圖5 基于屬水平細菌群落結(jié)構(gòu)分布

在大曲發(fā)酵過程中，葡萄球菌屬（）相對豐度逐漸增加，在大火階段增加幅度較大，發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定，可能與發(fā)酵溫度有關；乳桿菌屬（）從大火階段開始相對豐度減少；短桿菌屬（）從大火階段開始相對豐度增加；明串珠菌屬（）在大曲發(fā)酵過程中一直存在，在大火階段前相對豐度較高，在大火階段后相對豐度較低；歐文氏菌屬（）在大曲發(fā)酵過程中一直存在，在大火結(jié)束時豐度最高，試驗組7.5%，對照組4.8%；醋酸桿菌屬（）在發(fā)酵過程中先增加后降低，在潮火結(jié)束時豐度最高，試驗組5.6 %，對照組3.4 %，大曲出房時，醋酸桿菌屬相對豐度分別是試驗組1.0%，對照組0.9 %；棒桿菌屬（）在大曲發(fā)酵過程中相對豐度逐漸增加，出房曲相對豐度分別是試驗組1.8%，對照組1.4%。葡萄球菌屬（）為革蘭氏陽性球菌，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度為37 ℃，多數(shù)葡萄球菌能分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；乳桿菌屬（）為革蘭氏陽性，不生孢，兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，發(fā)酵分解糖代謝，終產(chǎn)物中50 %以上是乳酸；短桿菌屬（）是放線菌目中一屬專性好氧、過氧化氫酶陽性、無芽孢的革蘭氏陽性段桿狀細菌；明串珠菌屬屬于乳酸菌，利用葡萄糖進行異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生D 型乳酸、乙酸或醋酸；歐文氏菌屬（）屬于好氧或者兼性厭氧發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌，能分解果糖、半乳糖、D-葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸；醋酸桿菌屬（）是一類能使糖類和酒精氧化成醋酸等產(chǎn)物的短桿菌，革蘭氏陽性，極端嚴格好氧，因此，在大火期之后，醋酸桿菌屬相對豐度降低。

出房曲樣本中相對豐度含量較高的依次是葡萄球菌屬（）、乳桿菌屬（）、短桿菌屬（）、一類未鑒定的屬（undentified）、棒桿菌屬（）、明串珠菌屬（）、短狀桿菌屬（）。試驗組和對照組的區(qū)別在于對照組中鏈霉菌屬（）相對豐度較高，為4.4 %，試驗組中鏈霉菌屬相對豐度為0.8 %；對照組中歐文氏菌屬（）相對豐度較高，為2.2 %，試驗組相對豐度為0.7 %。鏈霉菌屬在發(fā)酵前期含量不大，且試驗組與對照組差異不大，從后火階段開始，鏈霉菌屬相對豐度逐漸增大，試驗組和對照組之間差異逐漸增大。有研究表明，大曲中的鏈霉菌產(chǎn)生的土味素(geosmin，GsM)是造成白酒土霉味的主要原因。造成該差異的原因需要進一步探究。

2.4 真菌群落多樣性

基于屬水平，試驗組和對照組在大曲發(fā)酵過程中群落結(jié)構(gòu)的演替情況見圖6，相對豐度小于1 %的并為other。

圖6 基于屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)分布

由圖6 可知，在真菌屬水平上，臥曲階段試驗組和對照組群落結(jié)構(gòu)有所差異。試驗組中，復膜孢酵母屬（）相對豐度最高，為61.5 %，其次是一類未鑒定的屬，相對豐度為33.5 %；對照組樣本物種豐富度較高，相對豐度由高到低依次是根霉屬（）28.0%、復膜孢酵母屬（）21.4 %、嗜熱子囊菌屬（）14.5 %、12.1 %、畢赤酵母屬（）7.4%、曲霉屬（）3.4%。

發(fā)酵過程中，復膜孢酵母屬（）相對豐度先增高后降低，之后趨于穩(wěn)定，上霉階段，復膜孢酵母屬（）相對豐度最高；上霉結(jié)束后，復膜孢酵母屬（）相對豐度逐漸減少，畢赤酵母屬（）相對豐度逐漸增加；根霉屬（）在發(fā)酵前期樣品中豐度較高，后期逐漸較少；在大曲發(fā)酵過程中先增高后降低，在晾霉階段相對豐度最高，分別是試驗組6.5 %，對照組19.3 %。復膜孢酵母屬屬于酵母菌，能產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶，且所產(chǎn)的酶都具有較高的活性，還具有一定的產(chǎn)香產(chǎn)酯能力，在釀酒工業(yè)中具有重要地位；畢赤酵母屬是工業(yè)發(fā)酵中釀酒酵母的有益補充，廣泛存在于發(fā)酵食物和水果中，能增加食品或飲料的風味，同時，具有多重耐受性和獨特的碳氮代謝，在生物能源領域具有巨大潛力。

在真菌屬水平上，出房曲樣本中畢赤酵母屬（）相對豐度最高，試驗組64.6 %，對照組64.5 %；其次是復膜孢酵母屬（），試驗組29.4%，對照組28.1%。試驗組和對照組之間無顯著性差異。

3 結(jié)論

采用Illumina Miseq 高通量測序技術對不同大麥品種培曲過程中細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律進行了分析。

從細菌群落結(jié)構(gòu)分析來看，隨著大曲發(fā)酵的進行，試驗組與對照組的細菌多樣性均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，且在晾霉階段與養(yǎng)曲階段多樣性變化幅度較大，出房曲的細菌豐富度和多樣性最高。雖然上霉階段二者的細菌多樣性有所差異，但是隨著發(fā)酵的進行，二者群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于相似。在細菌屬水平上，上霉階段試驗組和對照組群落結(jié)構(gòu)有所差異，對照組細菌多樣性較高。在發(fā)酵過程中，細菌多樣性呈逐漸增加的趨勢，試驗組和對照組出房曲樣本中相對豐度含量較高的依次是葡萄球菌屬（）、乳桿菌屬（）、短桿菌屬（）、棒桿菌屬（）和一類未能鑒別的屬等。試驗組和對照組的區(qū)別在于對照組中鏈霉菌屬（）相對豐度較高，為4.4 %，試驗組中鏈霉菌屬相對豐度為0.8%。造成該差異的原因需要進一步探究。

從真菌群落結(jié)構(gòu)分析來看，隨著大曲發(fā)酵的進行，試驗組與對照組的真菌多樣性均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，且在晾霉階段的Chao1 指數(shù)與Shannon 指數(shù)最高，說明該階段的真菌豐富度和多樣性最高。雖然臥曲階段二者的真菌多樣性有所差異，但是隨著發(fā)酵的進行，二者群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于相似。在真菌屬水平上，臥曲階段試驗組和對照組群落結(jié)構(gòu)有所差異，對照組樣本物種多樣性較高。在真菌屬水平上，出房曲樣本中畢赤酵母屬（）相對豐度最高，試驗組64.6 %，對照組64.5 %；其次是復膜孢酵母屬（），試驗組29.4%，對照組28.1%。試驗組和對照組之間無顯著性差異。

研究結(jié)果表明，大曲發(fā)酵的細菌群落變化的關鍵轉(zhuǎn)折點是大火階段，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化。乳桿菌屬相對豐度大幅減少，葡萄球菌屬相對豐度大幅增加；歐文氏菌屬、醋酸桿菌屬在大火階段相對豐度最高，大火階段之后逐漸減少；短桿菌屬從大火階段開始，相對豐度逐漸增加。原因可能是大火階段溫度較高，且隨著發(fā)酵的進行，曲塊逐漸由有氧環(huán)境變?yōu)闊o氧環(huán)境，造成了好氧菌相對豐度的降低，厭氧菌相對豐度的增加。隨著大曲發(fā)酵的進行，從大火階段開始，大曲真菌群落結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，且上霉的主要真菌屬是復膜孢酵母屬。雖然試驗組與對照組在臥曲階段細菌與真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，但是隨著大曲發(fā)酵的進行，二者的細菌與真菌群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于一致，大曲出房時，試驗組與對照組之間無顯著差異。由此表明，在大曲發(fā)酵過程中，發(fā)酵環(huán)境對大曲發(fā)酵的影響大于原料中的微生物。