何慶元，張宇龍，韓 偉，徐智明，李正鵬，任 義，楊 豪，詹秋文

（1. 安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院, 安徽 鳳陽 233100；2. 秋實(shí)草業(yè)有限公司, 安徽 五河 233300；3. 安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院, 安徽 鳳陽 233100）

隨人們生活水平提高，奶產(chǎn)品需求增大，優(yōu)質(zhì)牧草的生產(chǎn)在農(nóng)區(qū)牧草生產(chǎn)中越來越重要[1]，將南方農(nóng)業(yè)耕作制度由過去糧經(jīng)二元結(jié)構(gòu)調(diào)整為糧經(jīng)飼三元結(jié)構(gòu)模式成為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要舉措[2]。苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培面積最大的豆科牧草，具有草產(chǎn)量高、粗蛋白質(zhì)含量在20%左右、富含奶牛所需的各類營(yíng)養(yǎng)因子和良好的適口性，并且生物固氮能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被稱為牧草之王[3]。然而，長(zhǎng)期以來，由于南方氣溫高、濕度大，部分地區(qū)土壤呈酸性且質(zhì)地黏重、地下水位相對(duì)較高等對(duì)苜蓿生長(zhǎng)不利的條件，導(dǎo)致南方苜蓿推廣中合適的品種較少[4-5]，但隨著草產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，篩選出適合中部和南方種植的苜蓿品種十分必要。

淮河中下游地區(qū)水熱資源豐富，其環(huán)境具有發(fā)揮苜蓿高產(chǎn)潛力的基礎(chǔ)。近年來，雖然有少量關(guān)于該地區(qū)苜蓿生產(chǎn)相關(guān)的部分報(bào)道[6-7]，但該地區(qū)品種選擇還比較盲目，在該地區(qū)系統(tǒng)開展引種區(qū)域適應(yīng)性試驗(yàn)，并對(duì)該地區(qū)野生苜蓿資源進(jìn)行鑒定和比較試驗(yàn)對(duì)生產(chǎn)上有一定指導(dǎo)意義，為利用野生苜蓿資源和選育適合該地區(qū)種植的苜蓿品種充分發(fā)揮苜蓿的產(chǎn)量潛力奠定基礎(chǔ)。苜蓿秋眠性與產(chǎn)量和適應(yīng)性密切相關(guān)，是苜蓿引種栽培的重要依據(jù)[8]，并且不同休眠的苜蓿的遺傳多樣性存在差異[9-10]。遺傳的豐富度是品種產(chǎn)量、品質(zhì)和適應(yīng)性的本質(zhì)基礎(chǔ)。本研究在安徽淮河中下游地區(qū)選取了25份國(guó)內(nèi)外苜蓿材料分析其表型和基因型遺傳多樣性，并進(jìn)行生產(chǎn)適應(yīng)性及品質(zhì)比較，旨在為該地區(qū)苜蓿生產(chǎn)中選擇適宜品種提供指導(dǎo)和育種利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

2017年10月18日將試驗(yàn)材料播種于安徽省蚌埠市五河縣朱頂鎮(zhèn)秋實(shí)草業(yè)有限公司試驗(yàn)基地(117°52′ E， 33°18′ N)，該地區(qū)位于淮河中游下段、淮北平原東南部、半濕潤(rùn)農(nóng)業(yè)氣候區(qū)，日照時(shí)數(shù)年均2 306.7 h，無霜期年均212 d，年降水量896.3 mm。年均氣溫14.7 ℃，1月份最冷，月平均氣溫0 ℃；7月份最熱，月平均氣溫27.8 ℃。

1.2 試驗(yàn)材料

25個(gè)苜蓿品系，9個(gè)購自北京正道生態(tài)科技有限公司，6個(gè)購自百綠國(guó)際草業(yè)有限公司，6個(gè)由北京克勞沃生態(tài)科技有限公司饋贈(zèng)，4個(gè)由安徽科技學(xué)院安徽省飼草育種與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。品系名稱及原產(chǎn)地如附表1所列。

表1 不同品系對(duì)產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響Table 1 Effects of different varieties and lines on yield-related traits

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與田間管理

采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，小區(qū)面積9.0 m2(3 m ×3 m)，行距0.3 m，每個(gè)小區(qū)10行，按22.22 kg·hm-2播種量條播，3個(gè)重復(fù)。常規(guī)大田管理，人工鋤草，及時(shí)防治病蟲害。在苜蓿小區(qū)約50%開花時(shí)刈割，分別于2018年4月28日、6月5日、7月17日、8月23日和10月11日刈割5次，2019年4月25日、5月27日、7月5日、8月6日和10月11日刈割5次。

1.4 產(chǎn)量相關(guān)性狀測(cè)定及方法

株高是地表到植株頂端生長(zhǎng)點(diǎn)的絕對(duì)高度，主莖節(jié)數(shù)從子葉節(jié)開始計(jì)算，株高和主莖節(jié)數(shù)是每個(gè)小區(qū)隨機(jī)抽樣10株的平均值。鮮草產(chǎn)量：取中間8行稱量小區(qū)鮮草重，并換算為每畝(666.67 m2)鮮重。

1.5 品質(zhì)相關(guān)性狀測(cè)定及方法

每個(gè)小區(qū)500 g鮮草，經(jīng)105 ℃殺青30 min，后經(jīng)80 ℃烘干至恒重，將全部樣品粉碎，混合均勻，過0.425 mm孔徑篩，用于粗蛋白(crude protein,CP)、粗脂肪(ether extract, EE)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)含量測(cè)定。品質(zhì)性狀測(cè)定方法：CP按凱氏定氮法(GB/T6432-1994)，EE用索氏提取法(GB/T6433-2006)，NDF、ADF用笵氏測(cè)定法(Van Soest)[11]。相對(duì)飼用價(jià)值(relative feed value, RFV)利用NDF和ADF計(jì)算，RFV = DDM × DMI/1.29；其中可消化干物質(zhì)(digestible dry matter, DDM) =88.9 - (0.779 × ADF)，粗飼料干物質(zhì)隨意采食量(dry matter intake, DMI) = 120/NDF[12]。

1.6 DNA提取及SSR分析方法

從每個(gè)品系采集3株苜蓿葉片，混合，經(jīng)液氮研磨，用改良的CTAB法提取基因組DNA[13]，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶清晰，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

依Sledge等[14]發(fā)表的苜蓿公共圖譜，選取8對(duì)染色體上分布基本均勻的66個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行基因分型。SSR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，10 μL PCR體系中含有DNA 25 ng, Taq酶0.6 U，上下游引物各3 pmol, dNTPs 0.6 mmol，Mg2+20 pmol和10 × buffer 1 μL。擴(kuò)增程序先94 ℃預(yù)變性5 min；隨后94 ℃ 40 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

表型數(shù)據(jù)用Excel和SPSS 17.0進(jìn)行方差、新復(fù)極差檢驗(yàn)和聚類分析獲得相似性和進(jìn)化樹。

SSR標(biāo)記帶型通過人工統(tǒng)計(jì)，基因型數(shù)據(jù)用Powemarker軟件分析各品系之一的遺傳相似性系數(shù)[15]，用非加權(quán)配對(duì)法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)量相關(guān)性狀影響因素分析

方差分析結(jié)果表明，苜蓿鮮重、株高和主莖節(jié)數(shù)受到年份、品系、茬次3個(gè)因素、以及年份與茬次的交互作用的顯著影響(P＜ 0.05)，主莖節(jié)數(shù)還受到品種與茬次交互作用顯著影響(P＜ 0.05)，其他的交互作用對(duì)3個(gè)性狀均無顯著影響(P＞ 0.05)。鮮重最高的品種是‘WL363HQ’，其次依次是‘BaRaH416wet’、‘WL298HQ’和‘巨能551’，共23個(gè)品種與‘WL363HQ’間無顯著差異(P＞ 0.05) (表1)。黃花苜蓿的主莖節(jié)數(shù)和株高最高，其中主莖節(jié)數(shù)顯著高于其他品種(P＜0.05)。

不同茬次的苜蓿產(chǎn)量之間都有顯著性差異，并隨茬次推移，產(chǎn)量逐漸降低，第1茬產(chǎn)量最高(表2)。第2年平均產(chǎn)量是第1年的2.24倍，第2年第1茬產(chǎn)量更是第1年第1茬產(chǎn)量的6.74倍。不同茬次株高和主莖節(jié)數(shù)都是第3茬最高，但產(chǎn)量沒有隨株高和主莖節(jié)數(shù)增加而增加，株高和主莖節(jié)數(shù)對(duì)產(chǎn)量沒有影響，可能分蘗數(shù)才是影響產(chǎn)量的主要因素。

2.2 品質(zhì)相關(guān)性狀影響因素分析

經(jīng)方差分析表明，CP、ADF、NDF含量和RFV都受到品系、年份和茬次的顯著影響(P＜ 0.05)，而EE含量受到品系和茬次顯著影響(P＜ 0.05)，不受年份的影響。年份與品系交互作用顯著影響EE、ADF、NDF含量和RFV (P＜ 0.05)，年份與品種交互作用顯著影響CP、EE、ADF、NDF含量和RFV (P＜0.05)，品種與茬次交互作用顯著影響CP和ADF含量(P＜ 0.05)，三者的交互作用顯著影響CP、ADF和NDF含量(P＜ 0.05)。苜蓿CP含量變異幅度較小(表3)，變異范圍為21.09% ('WL440HQ')～23.54% (‘WL354HQ’)，并且‘WL358HQ’顯著高于‘WL363HQ’、‘WL712’、‘三德利’和‘WL440HQ’ (P＜0.05)，與其余品系沒有顯著差異(P＞ 0.05)。EE含量最高的是‘四季旺’(6.58%)，并顯著高于‘WL712’、‘WL366HQ’和‘巨 能995’ (P＜ 0.05)。RFV以‘WL354HQ’最 高，并 顯 著 高 于‘WL656HQ’、‘WL525HQ’、‘巨能601’、‘BaRaH416wet’和黃花苜蓿(P＜ 0.05)，而黃花苜蓿最低，顯著低于其余品種(P＜ 0.05)。

表3 不同品種對(duì)苜蓿品質(zhì)的影響Table 3 Effect of different varieties on quality traits

第1茬的CP和EE含量都最高，并顯著高于其余4個(gè)茬次(P＜ 0.05) (表4)，第2和4茬的CP和EE含量最低，兩茬之間沒有顯著差異(P＞ 0.05)。RFV不同茬次之間都存在顯著差異(P＜ 0.05)，并且第2茬最高，其次是第1茬，第4茬最低。從品質(zhì)性狀總體來看，第1茬草品質(zhì)最好。

表4 茬次對(duì)產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響Table 4 Quality-related traits of different batches

2.3 苜蓿品系間親緣關(guān)系分析

用平均歐式距離和組間連接法將表型數(shù)據(jù)間進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明所選25個(gè)苜蓿品系被聚為3個(gè)群，黃花苜蓿被單獨(dú)聚為一類，與其他苜蓿的遺傳距離較遠(yuǎn)；BaRaH416wet、WL298HQ、WL343HQ、WL363HQ和WL903這5個(gè)品種被聚為一類，其余19個(gè)品種被聚為一類(表5)。黃花苜蓿與WL363HQ遺傳距離最遠(yuǎn)，BaRa420YQ與WL319HQ遺傳距離最小(圖1A、附表2)。

利用66對(duì)在苜蓿8個(gè)連鎖群中分布均勻的SSR標(biāo)記聚類分析(圖1B、附表3)，結(jié)果表明，25個(gè)品系被分為兩類，‘BaRa420YQ’、‘BaRaH416wet’、‘WL168HQ’、 ‘WL298HQ’、 ‘WL319HQ’、‘WL343HQ’和‘WL354HQ’共7個(gè)品系被聚為一類，其余18個(gè)品系聚為另一類(表5)?！儇S’和‘WL298HQ’之間得遺傳距離最大，‘巨能601’與‘巨能801’之間的遺傳距離最小。表型和基因型聚類結(jié)果具有一定的差異，說明在育種中親本選配上既要考慮表型差異，也要從基因型上進(jìn)行選擇。

表5 表型和基因型聚類結(jié)果Table 5 Results of phenotypic and genotype clustering

圖1 25個(gè)苜蓿品系聚類分析圖Figure 1 Cluster diagram of 25 alfalfa varieties

3 討論與結(jié)論

3.1 淮河中下游地區(qū)苜蓿品種的適應(yīng)性評(píng)價(jià)

選擇適合淮河中下游地區(qū)種植的苜蓿品種，對(duì)促進(jìn)該地區(qū)草業(yè)的發(fā)展具有重要意義。試驗(yàn)結(jié)果表明 半 休 眠 的‘WL363HQ’、‘BaRaH416wet’、‘WL298HQ’和‘巨能551’都有較高的產(chǎn)量，并且‘BaRaH416wet’、‘WL298HQ’和‘巨能551’具有較高的蛋白質(zhì)和粗脂肪含量，與最高蛋白含量的品種‘WL358HQ’之間沒有顯著差異，它們的相對(duì)飼用價(jià)值也較高。其余半休眠品種其產(chǎn)量較高，因此淮河中下游地區(qū)苜蓿種植應(yīng)選擇半休眠品種。但產(chǎn)量與株高及主莖節(jié)數(shù)之間沒有相關(guān)性，可能影響苜蓿的產(chǎn)量主要因素是分蘗數(shù)，生產(chǎn)中通過促進(jìn)苜蓿分蘗達(dá)到高產(chǎn)的目標(biāo)。

淮河中下游地區(qū)苜蓿種植第2年產(chǎn)量是第1年的2倍以上，因此苜蓿該地區(qū)苜蓿種植應(yīng)多年利用，否則難以獲得較好經(jīng)濟(jì)效益。第1年產(chǎn)量第2茬最高，第2年第1茬產(chǎn)量最高，前2茬產(chǎn)量占了全年總產(chǎn)量50%以上，并且其蛋白質(zhì)、粗脂肪含量和相對(duì)飼用價(jià)值也是第1和2茬較高，這可能是該地區(qū)第3茬以后氣溫過高，影響了苜蓿生長(zhǎng)。

3.2 苜蓿表型和基因型之間的親緣關(guān)系

剖析不同種質(zhì)資源的表型組和基因組之間的關(guān)聯(lián)程度為育種中的親本選配提供指導(dǎo)，特別是在育種過程中將地方種質(zhì)資源中的優(yōu)異基因?qū)雰?yōu)異品種達(dá)到改良品種的目標(biāo)，具有重要價(jià)值。本研究收集了當(dāng)?shù)氐狞S花苜蓿資源，其具有更多的主莖節(jié)數(shù)和更高的株高等優(yōu)良特性[16]，是優(yōu)異的地方資源，但產(chǎn)量相對(duì)較低，通過雜交回交等將優(yōu)良基因?qū)敫弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿品種中，具有十分重要的意義?；蛐秃捅硇蛿?shù)據(jù)聚類并不一致，這可能是因?yàn)檐俎Ｊ峭串惢诜鄣乃谋扼w，其表型受基因型控制比二倍體更復(fù)雜，不但受到基因位點(diǎn)的顯性、上位性和共顯性等的影響，同時(shí)還受到基因劑量的影響，SSR標(biāo)記所做的基因型分析并不能體現(xiàn)基因劑量，可能會(huì)導(dǎo)致基因型和表型的不一致，但基因型之間能夠反映基因組之間的遺傳距離關(guān)系[17]。因此僅僅通過表型判斷苜蓿之間的遺傳關(guān)系是不準(zhǔn)確，親本選配時(shí)，需要表型上選擇綜合性狀優(yōu)良，差異互補(bǔ)，基因型差異大的品系作為雜交親本，在后代中更容易選擇出優(yōu)良品種，本研究能夠?yàn)榛春又邢掠蔚貐^(qū)苜蓿品種選育親本選配提供指導(dǎo)。