陳娜娜，安雪姣，滿永恒，李討討，王 霞，馬友記

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院, 甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省動物生殖生理及繁殖調(diào)控重點實驗室, 甘肅 蘭州 730070；3. 永昌縣肉用種羊繁育技術推廣站, 甘肅 金昌 737200）

過氧化物酶(peroxidases of the peroxiredoxin, Prx)最初在酵母中被發(fā)現(xiàn)，是分子大小為20～30 kDa的過氧化物酶家族，該家族的基本生物學功能是防止細胞氧化損傷[1]。而過氧化物氧化還原酶(peroxiredoxin,PRDX)家族是在原核生物和真核生物中廣泛分布的抗氧化劑酶家族[2]，在惡行腫瘤[3]、器官衰老[4]、神經(jīng)性疾病[5]、癌癥[6]等生物學過程中發(fā)揮作用。其家族中的過氧化物氧化還原酶5 (peroxiredoxin 5,PRDX5)是一種分子大小17 kDa的硫氧還蛋白過氧化物酶，也被稱為PrxV、ACR1、PMP20或AOEB166，在甲狀腺、氣管、腎臟、肺、腎上腺、心臟等多個組織中高表達[7-8]。PRDX5在哺乳動物中除了在細胞增殖中發(fā)揮作用，還可以中和動物生命活動過程中產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species, ROS)來阻止氧化劑毒性對細胞的損傷[9-10]。

藏綿羊(Ovis aries)原產(chǎn)于青藏高原，是世界上最常見、分布最廣的馴養(yǎng)動物。因其長期生活在低氧高海拔環(huán)境，使其形成了抗嚴寒、耐粗飼、適應高海拔，但性成熟晚的特點。睪丸是雄性動物精子發(fā)生、發(fā)育和成熟的重要場所，在精子發(fā)生過程中會產(chǎn)生ROS[11]。ROS是細胞新陳代謝的產(chǎn)物之一，發(fā)生在所有有氧生物機體中，作為含氧分子的高反應性基團，ROS包括自由基，例如超氧陰離子(O2-)、羥基自由基(-OH)，以及非自由基分子，例如過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(O2)等[12]。適當水平的ROS是維持精子發(fā)生正常進行的一個關鍵因素[13]，但是研究發(fā)現(xiàn)在低壓缺氧條件下，精子發(fā)生過程中因受到氧化應激影響會產(chǎn)生過量的ROS，使睪丸組織受損，精子發(fā)生受阻，影響精液品質(zhì)并誘導DNA損傷和凋亡[14-15]。而PRDX5可以還原細胞產(chǎn)生的過量ROS，保證精子活力并維持ROS的穩(wěn)態(tài)，而且有研究證明PRDX5在細胞中過表達可以保護細胞免受氧化應激威脅[16]，抑制細胞中PRDX5表達會誘導細胞氧化應激，ROS水平升高，從而導致細胞死亡[17-18]。因此PRDX5基因表達水平的高低可能與精子發(fā)生狀態(tài)和睪丸細胞發(fā)育相關。目前，關于PRDX5的研究主要集中在人[19-20]、大小鼠[21]、犏牛和牦牛[22]上，藏綿羊上鮮有報道，故本研究通過對PRDX5在性成熟前后的藏綿羊睪丸組織中的表達情況和分布模式進行研究，初步探究PRDX5在藏綿羊睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過程中的作用，為提高藏綿羊繁殖力提供參考依據(jù)。

1 材料及試劑

選擇性成熟前(3月齡)、性成熟期(1周歲)和成年(3周歲)的健康雄性藏綿羊各8 只(甘肅省夏河藏羊養(yǎng)殖合作社提供)，屠宰后采集每只藏綿羊的睪丸組織。

本試驗所用試劑中的Trans Zol UP RNA提取試劑盒和2 × Fast qPCR Master Mixture試劑盒采購于全式金生物技術有限公司(北京)，Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒采購于艾科瑞生物科技有限公司(湖南)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒采購于天根生化科技有限公司(北京)，高效RIPA裂解液和6 × SDS (sodium dodecyl sulfate, SDS)上樣緩沖液采購于索萊寶科技有限公司(北京)，PRDX5和β-actin的兔源一抗、山羊抗兔二抗、免疫組織化學染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色試劑盒采購于博奧森生物技術有限公司(北京)。

2 試驗方法

2.1 總RNA提取及cDNA合成

將采集的藏綿羊睪丸組織根據(jù)Trans Zol UP RNA提取試劑盒的操作方法提取各階段的RNA各20 uL。瓊脂糖檢測合格后利用Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 引物設計與合成

根據(jù)NCBI提供的綿羊PRDX5和β-actin的mRNA序列利用Primer Premier 6.0軟件設計引物后送至中科羽瞳生物科技有限公司合成(表1)。

2.3 藏綿羊PRDX5基因克隆

以藏綿羊睪丸組織cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為20 μL：cDNA模板1.5 μL，上、下游引物(10 mmol·L-1) (表1)各0.5 μL，高保真DNA聚合酶(1 U·m-1) 10 μL，用ddH2O補至20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃2 min，32個循環(huán)；72 ℃ 2 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后獲得659 bp大小的片段，根據(jù)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的操作說明對目的片段純化并回收，連接轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)后隨機挑選4個單菌株鑒定后送至中科羽瞳生物科技有限公司進行測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2.4 qRT-PCR及PRDX5 mRNA的相對表達量

根據(jù)2 × Fast qPCR Master Mixture試劑盒的操作說明進行qRT-PCR擴增。使用2-ΔΔCt方法對qRT-PCR中所得到的Ct值進行結果計算，得出不同階段睪丸組織中PRDX5的mRNA相對表達量。

2.5 Western blot及PRDX5蛋白相對表達量

使用高效RIPA裂解液提取各階段藏綿羊睪丸組織蛋白后與6 × SDS上樣緩沖液按5 : 1混勻后在100 ℃金屬浴中加熱10 min使其充分變性。放置室溫后將蛋白樣品加入12% SDS-PAGE，40 V電泳6 h后恒壓100 V濕轉(zhuǎn)45 min，取出聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride, PVDF)，用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液室溫封閉2 h，然后加入PRDX5 (1 :700)和β-actin (1 : 1 500)的兔源一抗，置于4 ℃冰箱孵育12 h。第2天把PVDF膜用PBST洗滌(3次，每20 min一次)后加入山羊抗兔二抗(1 : 5 000)，常溫孵育2 h。PBST洗滌(4次，每次15 min)后進行化學曝光。Western blot條帶灰度值由AlphaEaseFC 6.0圖像分析軟件掃描測定后計算PRDX5蛋白的相對表達量。

2.6 免疫組織化學染色

將制備好的石蠟切片置于60 ℃烘箱中4 h，然后依次進行脫蠟、脫水、抗原修復處理。將切片放置10 mim后按照免疫組織化學染色試劑盒的說明書進行操作，其中一抗PRDX5稀釋比例為1 : 150，陰性對照用PBS代替一抗。切片用PBS清洗(3次，每7 min一次)后用DAB顯色試劑盒顯色，自來水終止，蘇木素復染，1% HCl-酒精分化，梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。待切片自然風干后使用Olympus Dp71生物顯微鏡(日本)觀察并拍照。

2.7 系統(tǒng)進化樹構建和克隆序列分析

使用DNAMAN 6.0軟件對克隆得到的序列與其他物種進行氨基酸序列比對。利用MEGA7.0軟件中的鄰位相連法(neighbor-joining method, NJ Method)構建系統(tǒng)進化樹。利用ProtPara、Signal-4.0、SOPMA和phyre2在線軟件對PRDX5基本理化性質(zhì)、信號肽、蛋白二級和三級結構進行預測分析。

3 結果與分析

3.1 藏綿羊PRDX5基因CDS序列特征

本研究獲得大小為659 bp的目的片段(圖1)。BLAST比對后發(fā)現(xiàn)藏綿羊PRDX5的氨基酸序列與NCBI中提供的綿羊序列(XM_004019653.4)完全一致；氨基酸序列同源性比對結果顯示，藏綿羊PRDX5序列與山羊(Capra hircus)、普通牛(Bos taurus)、馬(Equus caballus)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、豬(Susscrofa)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的序列相似度分別為99.09%、94.52%、79.45%、74.89%、66.21%、55.71%和55.25%(圖2)；蛋白空間結構由α-螺旋(33.33%)、延伸鏈(22.37%)、β-轉(zhuǎn)角(8.68%)和無規(guī)則卷曲(35.62%)組成(圖3和圖4)；理化性質(zhì)預測發(fā)現(xiàn)，PRDX5蛋白的分子式為C1039H1671N285O297S8，分子量為23 163.91 kD，理論等電點為8.62，不穩(wěn)定系數(shù)為33.06，屬于穩(wěn)定蛋白且無信號肽(圖5)。系統(tǒng)進化樹顯示藏綿羊與山羊親緣關系最近(圖6)；總平均親水性為0.185，脂肪系數(shù)為97.49，正負電荷殘基數(shù)分別為22和25。

圖1 藏綿羊PRDX5基因目的片段檢測圖譜Figure 1 Detection map of the target fragment of Tibetan sheep PRDX5 gene

圖2 PRDX5氨基酸序列比(對同源性 ＞ 50%)Figure 2 PRDX5 amino acid sequence ratio (Homology ＞ 50%)

圖3 藏綿羊PRDX5蛋白二級結構組成Figure 3 The secondary structure of Tibetan sheep PRDX5 protein

圖4 藏綿羊PRDX5蛋白三級結構預測Figure 4 Prediction of tertiary structure of Tibetan sheep PRDX5 protein

圖5 藏綿羊PRDX5蛋白信號肽預測Figure 5 Prediction of the signal peptide of Tibetan sheep PRDX5 protein

圖6 藏綿羊PRDX5基因系統(tǒng)進化樹構建Figure 6 Construction of a phylogenetic tree of Tibetan sheep PRDX5 gene

3.2 PRDX5 mRNA在睪丸組織中的表達

qRT-PCR方法結果(圖7)顯示，1周歲(性成熟期)和3周歲(成年)藏綿羊睪丸組織中PRDX5mRNA的相對表達量極顯著高于3月齡(性成熟前) (P＜0.01)，并在性成熟后趨于穩(wěn)定。

圖7 藏綿羊睪丸中PRDX5 mRNA的表達Figure 7 Expression of PRDX5 mRNA in Tibetan sheep testis

3.3 PRDX5蛋白在睪丸組織中的表達

Western blot方法結果(圖8)顯示，1周歲(性成熟期)和3周歲(成年)藏綿羊睪丸中PRDX5蛋白表達量極顯著低于3月齡(性成熟前) (P＜ 0.01)，并在性成熟后趨于穩(wěn)定。

圖8 藏綿羊睪丸中PRDX5蛋白的表達Figure 8 Expression of PRDX5 Protein in Tibetan sheep testis

3.4 PRDX5蛋白在睪丸組織中的定位

免疫組織化學染色方法結果(圖9)顯示，PRDX5蛋白定位在不同發(fā)育階段的睪丸支持細胞和間質(zhì)細胞，且在支持細胞連接處也有分布。

圖9 藏綿羊睪丸組織中PRDX5蛋白分布Figure 9 Distribution of PRDX5 protein in Tibetan sheep testis

4 討論與結論

本研究克隆得到的藏綿羊PRDX5基因的CDS區(qū)長659 bp，可編碼219個氨基酸，這與NCBI中提供的綿羊序列(XM_004019653.4)完全一致，說明PRDX5基因可能在整個進化過程中高度保守。qRTPCR和Western blot結果顯示，PRDX5從性成熟前到性成熟期其表達量在mRNA水平上呈增長趨勢并在性成熟后趨于穩(wěn)定，而蛋白水平正好相反，其原因可能與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中受到多個層面的調(diào)控有關[23]。PRDX5蛋白在性成熟前的藏綿羊睪丸組織中表達量較高，PRDX5作為一種重要的過氧化物酶，具有抗氧化劑和抗凋亡功能[24]，PRDX5在細胞內(nèi)高表達會抑制ROS的生成和積累[25]，使細胞免受氧化應激，且低水平的ROS在多種生物學過程中充當分子信使的角色[26]，有利于細胞發(fā)揮功能。隨著藏綿羊的生長其睪丸中PRDX5的水平逐漸降低，可能導致ROS的水平逐漸升高，高水平的ROS可能使睪丸組織氧化受損，發(fā)育減慢，性成熟較其他品種晚。

免疫組織化學染色結果顯示PRDX5基因在藏綿羊不同發(fā)育階段睪丸支持細胞和間質(zhì)細胞中都有分布，睪丸支持細胞在精子發(fā)生過程中起核心作用，其與生殖細胞之間構成的血睪屏障(blood-testis barrier,BTB)是精子發(fā)生順利進行的保障。除此之外，支持細胞還參與排精過程[27]。睪丸間質(zhì)細胞在雄性生殖發(fā)育過程至關重要，其主要作用是合成和分泌睪酮，睪酮是在雄性動物青春期第二性征發(fā)育和成年期精子發(fā)生方面發(fā)揮關鍵作用的一種類固醇激素[28-29]。性成熟前因PRDX5的調(diào)節(jié)，低含量的ROS有利于BTB的結構完整，使精子發(fā)生微環(huán)境處于穩(wěn)定狀態(tài)，并保證間質(zhì)細胞順利合成并分泌睪酮。性成熟后，藏綿羊睪丸組織中PRDX5蛋白表達量降低，可能導致細胞中ROS含量升高，過量的ROS與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)反應導致細胞內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，使細胞處于氧化應激狀態(tài)[30]。氧化應激是指氧化劑或活性物質(zhì)活性氧[31]及抗氧化劑作用失衡的一種狀態(tài)，傾向氧化狀態(tài)，一般情況下會對機體產(chǎn)生負面作用[32]，它被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。支持細胞氧化損傷會導致生精細胞凋亡，曲細精管結構改變，精子運動能力減弱[33-34]，從而導致精子發(fā)生異常和排精困難。間質(zhì)細胞氧化損傷后引起線粒體功能損傷及睪酮合成障礙[35]，影響藏綿羊精子發(fā)生和睪丸功能。藏綿羊長期生活在低氧高海拔地區(qū)，紫外線等外源性誘導因素也會促進睪丸細胞產(chǎn)生過量線粒體ROS，對精子發(fā)生過程產(chǎn)生不利影響[36-37]。PRDX5蛋白表達從性成熟期開始降低，細胞更容易受到氧化損傷和細胞凋亡。在氧化應激誘導下，精子DNA受損，受精能力減弱[36,38]，這可能也是影響藏綿羊繁殖力的潛在因素之一。以上結果顯示性成熟后藏綿羊睪丸組織中PRDX5蛋白表達量降低可能導致藏綿羊睪丸組織氧化受損，細胞凋亡加速，抑制精子發(fā)生和成熟，對藏綿羊繁殖造成不利影響。但PRDX5在精子抗氧化防御機制中對ROS水平的具體調(diào)控機制有待進一步研究。