林 俊，劉 鑫，楊飛云，齊仁立*

（1.重慶市農(nóng)業(yè)學校，重慶九龍坡 401329；2.重慶市畜牧科學院，重慶榮昌 402460；3.西南大學動物科技學院，重慶榮昌 402460）

成年動物的肌肉蛋白長期處于合成與降解的動態(tài)平衡。促進肌肉蛋白質(zhì)合成，減少蛋白降解是維持正常肌肉體積和生理功能的主要途徑。鈣蛋白酶系統(tǒng)在骨骼肌細胞的蛋白降解和代謝周轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，影響了肌肉發(fā)育和生理穩(wěn)態(tài)，也對動物宰后的肉品嫩度有重要影響（王勝軍等，2016；Tipton和 Wolfe，2001）。

1 鈣蛋白酶系統(tǒng)的組成

鈣蛋白酶系統(tǒng)由多種鈣蛋白酶（Calpain，CAPN）和鈣蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）組成。CAPN是一類胱氨酸蛋白酶，可催化不同類型的蛋白底物水解（Hyatt等，2020）。CAPN的活化和蛋白水解功能發(fā)揮都依賴于細胞內(nèi)Ca2+濃度。最主要的CAPN可被分為μ-鈣蛋白酶（1-鈣蛋白酶，CAPN 1）和m-鈣蛋白酶（2-鈣蛋白酶，CAPN 2），它們分別需要微摩爾和毫摩爾Ca2+的激活，在不同組織都有廣泛表達分布（Huang等，1998）。此外，被發(fā)現(xiàn)了還有13種CAPN同工酶，它們參與了眾多鈣離子調(diào)節(jié)的細胞活動，如信號傳導(dǎo)、細胞增殖、細胞分化等（Du等，2019；Leloup等，2011；張勇等，2007）。

CAST是生物內(nèi)源性專一抑制CAPN活性的蛋白質(zhì)，位于細胞的胞質(zhì)溶液中，與CAPN共存（Du等，2019；張勇和鄧科，2011）。CAPN與Ca2+結(jié)合后會產(chǎn)生蛋白結(jié)構(gòu)的變化，CAST能準確識別這種變化并與之結(jié)合，抑制CAPN的催化活性（Wendt等，2004）。

骨骼肌組織中主要存在CAPN 1、CAPN 2、CAPN 3和 CAPN 10（Hata等，2020；許梓榮，2002）。CAPN 3在骨骼肌中特異性表達，在肌原纖維形成方面具有重要作用。CAPN 3基因的突變會引起肌肉發(fā)育不健全和多種肌營養(yǎng)不良癥，特別是肢帶肌營養(yǎng)不良2A癥也被稱為鈣蛋白酶病（Lasa-Elgarresta等，2019）。還有研究指出，CAPN 3可能參與了骨骼肌細胞的生成和細胞凋亡調(diào)控（Dargelos等，2002）。

2 鈣蛋白酶家族結(jié)構(gòu)和激活機制

2.1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu) 多數(shù)CAPN都是異源二聚體結(jié)構(gòu)，由序列不同的80kda催化亞基（大亞基）和序列相同的30kda調(diào)節(jié)亞基（小亞基）組成。典型大亞基包括4個結(jié)構(gòu)域（Ⅰ-Ⅳ），而小亞基包括2個（Ⅴ、Ⅵ）結(jié)構(gòu)域（圖1）（許梓榮等，2002；Huang等，1998）。

位于氨基端的結(jié)構(gòu)域Ⅰ在CAPN活化后會發(fā)生自溶，對維持CAPN空間結(jié)構(gòu)及對酶活化所需的空間構(gòu)象變化發(fā)揮重要作用。結(jié)構(gòu)域Ⅱ是蛋白酶水解活性的關(guān)鍵部位，由2個子域組成（Ⅱa和Ⅱb）。構(gòu)象發(fā)生變化后，結(jié)構(gòu)子域Ⅱa上的氨基酸殘基Cys-105和結(jié)構(gòu)子域Ⅱb上的His-262和Asn-286會接近，并形成催化活性中心（催化三聚體），是蛋白酶的主要水解活性位點。結(jié)構(gòu)域Ⅲ上有1個由8～10個酸性氨基酸殘基組成的酸性環(huán)，是結(jié)構(gòu)域Ⅳ和Ⅵ的調(diào)節(jié)中心。酸性氨基酸殘基的數(shù)量越少，Ca2+結(jié)合能力越弱。位于大亞基羧基端的結(jié)構(gòu)域Ⅳ和小亞基上同樣位于羧基端的結(jié)構(gòu)域Ⅵ是鈣離子結(jié)合域，都含有5個EF-手型鈣離子連接序列。小亞基的另1個結(jié)構(gòu)域Ⅴ位于氨基末端且富含甘氨酸（約60%左右），具有強疏水作用，對維持大亞基的正確空間構(gòu)型不可或缺（Reverter等，2001）。

CAPN 3是由單體蛋白組成，增加了3個獨立序列結(jié)構(gòu)單元：NS、IS1和IS2，分子量達到 94KDa（圖 1）（Hata等，2020；Hiroyuki和Yasuko，2012）。CAST 并不能有效結(jié)合和抑制CAPN 3，相反還是CAPN 3的水解底物（齊曾鑫等，2013）。

2.2 鈣蛋白酶抑制蛋白的結(jié)構(gòu) CAST含有5個結(jié)構(gòu)區(qū)域，包括有4個重復(fù)結(jié)構(gòu)單位（I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）和1個L結(jié)構(gòu)區(qū)。位于氨基末端的L區(qū)是Ca2+的通道調(diào)節(jié)區(qū)，而每個重復(fù)結(jié)構(gòu)單位又包含3個序列保守區(qū)（A區(qū)、B區(qū)、C區(qū)），是CAPN的抑制區(qū)（圖 1）；楊雪梅等，2007；Wendt等，2004）。

圖1 鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖

2.3 鈣蛋白酶的激活機制 Moldveanu等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，細胞中游離的Ca2+濃度不足時，CAPN的子結(jié)構(gòu)域IIa和IIb之間的裂縫由于結(jié)構(gòu)域間的相互吸引而被封閉。結(jié)構(gòu)域IIa上和IIb上構(gòu)成酶活性中心的3個氨基酸殘基Cys105、His262和Asn286彼此分離。當細胞中的Ca2+濃度快速上升到一定程度后會結(jié)合并誘發(fā)CAPN的結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生改變，大亞基上的結(jié)構(gòu)域I發(fā)生自溶，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域IIa和IIb之間的裂縫封閉移除，氨基酸殘基相互接近并形成催化三聚體（酶活中心），CAPN開始發(fā)揮蛋白水解催化活性（Nakagawa等，2001）。

3 鈣蛋白酶調(diào)控的骨骼肌蛋白降解

3.1 骨骼肌蛋白降解的不同途徑 人和動物的骨骼肌細胞中肌原纖維蛋白占肌肉蛋白總量的55%～60%，其中肌球蛋白和肌動蛋白是最主要的兩種（Goll等，2008）。在肌細胞內(nèi)存在3種主要的蛋白降解途徑：溶酶體途徑、鈣蛋白酶途徑和泛素-蛋白酶體途徑（Neti等，2009）。由于哺乳動物的肌原纖維尺寸較大（粗1～3 μm，長 1～ 40 μm），無法進入溶酶體（直徑通常0.2～0.8 μm）進行分解。而泛素-蛋白酶體只能降解單個肌原纖維蛋白，當肌原纖維交聯(lián)時就不能被降解（Solomon，1996）。CAPN可能是骨骼肌蛋白降解的發(fā)起者和主要限速步驟，它首先催化肌細胞中大量肌原纖維解聯(lián)、降解并釋放出粗肌絲和細肌絲，然后肌絲及其組分蛋白又被其他蛋白水解途徑單獨或協(xié)同分解。

3.2 鈣蛋白酶系統(tǒng)介導(dǎo)的骨骼肌蛋白降解 CAPN在骨骼肌細胞中催化的蛋白降解通常只針對肌原纖維。CAPN參與并調(diào)控了肌原纖維降解并釋放出肌絲的過程（Neti等，2009；趙紅艷，2008）。肌細胞中的CAPN主要存在于肌原纖維Z線（z-line）附近。CAPN活化后，首先會迅速分解Z線附近的肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白，然后繼續(xù)分解中間絲蛋白及肌纖維膜上的索蛋白，隨后α-輔肌動蛋白等被釋放出來，直至Z線消失（Sorichter等，1999）。分解下來的肌聯(lián)蛋白、肌球蛋白等進一步降解還需要泛素蛋白酶體、溶酶體、線粒體蛋白酶等其他水解酶的參與。

3.3 鈣蛋白酶影響動物肉品嫩度 CAPN催化的肌原纖維降解也是動物肌肉宰后嫩度提高和肉品成熟的主要原因（Huang等，2019；Huff 等，2010；王媛媛等，2006）。正常狀態(tài)下，動物肌細胞中Ca2+濃度較低，不足以激活鈣蛋白酶，而在動物處死后，肌漿網(wǎng)上的Ca2+大量外泄，CAPN（主要是CAPN1）被激活，啟動肌纖維蛋白降解。動物死后肌肉中CAPN 1的活性大概在24h后基本消失。

4 營養(yǎng)對鈣蛋白酶系統(tǒng)的影響

4.1 營養(yǎng)水平對鈣蛋白酶系統(tǒng)的影響 日糧營養(yǎng)素或營養(yǎng)水平變化會導(dǎo)致動物肌肉生理特性的改變與鈣蛋白酶系統(tǒng)存在緊密的聯(lián)系。一些研究認為，肌肉中的CAST更容易被日糧營養(yǎng)所影響。Helman等（2003）犬類研究表明，日糧營養(yǎng)水平僅對CAST產(chǎn)生明顯的影響，但是對CAPN的催化活性影響不顯著。相似地，Du等（2004）在牛上的試驗結(jié)果表明限飼并不影響肌肉中CAPN的活性，但顯著降低了CAST的調(diào)控影響，導(dǎo)致肌肉塊減小。但還有一些研究指出，CAPN也會受到營養(yǎng)水平的影響。Ilian等（1992）研究發(fā)現(xiàn)，長期禁食使兔的肌肉蛋白降解程度增加2倍，CAPN 1，CAPN 2和CAST的mRNA水平分別提高4.2倍、4.5倍和3.2倍，這使肌肉體積減小并導(dǎo)致骨骼肌萎縮。Tang等（2010）在豬上的研究指出，適度降低營養(yǎng)水平會增加育肥豬肉品嫩度，增加肌肉中CAPN的mRNA水平。

4.2 功能性營養(yǎng)素對鈣蛋白酶系統(tǒng)的影響 一些功能性營養(yǎng)物質(zhì)也可影響和調(diào)控鈣蛋白酶系統(tǒng)。使用富含亮氨酸（3%）的食物飼喂帶有癌癥腫瘤的的妊娠母鼠，能強化其子代小鼠肌肉的蛋白周轉(zhuǎn)，保持肌肉組織中CAPN的活性（Miyaguti等，2019）。Choi等（2012）給小鼠補充維生素D3三周發(fā)現(xiàn)，背最長肌中的脂肪含量明顯增加，并提高肌肉中CAPN 1含量，減少CAST含量。給大鼠補充大豆提取蛋白可顯著提高其運動能力，對抗運動導(dǎo)致腿部肌肉損傷，抑制CAPN 1和CAPN 2的激活，提高CAST的蛋白活性（Nikawa等，2002）。Tang等（2008）發(fā)現(xiàn)，在屠宰前 5 d給商品豬補充天冬氨酸鎂（2000 mg/kg）可顯著提高宰后豬肉中CAST含量，減輕運輸和屠宰應(yīng)激對肉嫩度的負面影響。顯然，研究并建立以鈣蛋白酶系統(tǒng)為靶點的精準營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)可提高動物產(chǎn)肉性狀和改善肉品質(zhì)。

5 小結(jié)

鈣蛋白酶系統(tǒng)在肌細胞蛋白降解過程中扮演了重要的調(diào)控角色，影響肌肉生長與生理穩(wěn)態(tài)，且對動物肉品質(zhì)具有重要影響。研究并利用精準營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)靶向調(diào)控CAPN和CAST的表達與活性，可能是未來提高動物產(chǎn)肉量和改善肉品質(zhì)的一種新的調(diào)控措施。