白家峰，熊亞妹，劉遠上，孫懿巖，劉紹華，賈學偉，許春平

（1.廣西中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，南寧 530001；2.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，鄭州 450002；3.河北中煙工業(yè)有限責任公司，石家莊 050000）

山藥為薯蕷科薯蕷屬，為薯蕷屬植物地下塊莖。由于塊莖富含尿囊素、多糖、黏蛋白、各種維生素、皂苷和微量元素［1，2］，具有降脂降壓、延緩衰老、強健脾胃、抑制腫瘤等功效［3-6］，是藥食同源的植物［7］，也是中國重要的出口特色蔬菜和保健品配料之一。

對多糖結(jié)構(gòu)進行修飾是目前多糖領(lǐng)域的研究重點之一［8］。采取有效的方法對多糖結(jié)構(gòu)修飾是增加其生物活性并促進其生物活性呈現(xiàn)的有效方式。如欒芳［9］通過化學修飾的方法，引入季銨基團，結(jié)果表明，季銨基團不僅能提高抗氧化能力，還能增強抑菌活性。季銨基團增強了殼聚糖衍生物的正電荷密度，季銨基團越多，活性越好。季銨基團是抑菌活性提高的主要因素，季銨基團越多，抑菌活性越好。季銨鹽化多糖具有良好的親水性、生物可降解性、生物相容性和抗菌活性等性能，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值［10］。

目前從天然植物中提取多糖作為新型的保潤劑成為一個研究熱點，相關(guān)報道表明這種新型保潤劑不僅使煙絲能夠保潤防潮，降低煙氣中的煙堿和焦油量，同時可以提高燃吸的感官質(zhì)量，增加香味［11］?，F(xiàn)在對天然植物多糖結(jié)構(gòu)修飾的研究較多，但未見對山藥多糖進行氨取代以及氨取代山藥多糖的保潤性能的研究。本研究對懷山藥多糖進行氨取代修飾，并將修飾前后的多糖加入煙絲中進行保潤性研究，以期為研制出一種新型煙草保潤劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：煙絲，河南中煙許昌卷煙廠；脫脂山藥粉，產(chǎn)自河南焦作懷山藥。

試劑：α-淀粉酶、CH3I、H2O2、NaCl、NaBH4、KBr，天津市大茂化學試劑廠；NaOH，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；氯仿，煙臺市雙雙化工有限公司；正丁醇，天津市富宇精細化工有限公司；（3-氯-2-羥丙基）三甲基氯化銨溶液，德州曼巴商貿(mào)有限公司；丙二醇，天津市風船化學試劑科技有限公司；二甲基亞砜，鄭州艾克姆化工有限公司；纖維素酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；BSTFA-TMCS（99∶1），東京化成工業(yè)株式會社。以上試劑均為分析純。D6-二甲基亞砜（99.9%），鄭州艾克姆化工有限公司，為色譜級。分子篩，上海麥克林生化有限公司。

儀器：SCIENTZ-10N冷凍干燥機、NB-DZF-6050真空干燥箱，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；MSH280-Pro磁力攪拌機、Cence湘儀TDZ5-WS離心機、N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；BINDER恒溫恒濕箱、ATY124電子天平，上海本熙測控設(shè)備科技有限公司；MB-1-1封閉式調(diào)溫加熱器，北京科偉永興儀器有限公司；DHG-914385-III電熱恒溫鼓風干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Nicolet5700傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國布魯克海文儀器公司；尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光聯(lián)用儀（SEC/MALLS/RI），美國懷亞特技術(shù)公司；UV-17001C紫外分光光度計，上海鳳凰光學科儀有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 山藥多糖的提取取經(jīng)乙酸乙酯脫脂過的山藥粉200 g，加入0.9%（質(zhì)量分數(shù)，下同）NaCl溶液4 000 mL，加熱至50～60℃浸提。攪拌24 h后加入0.25%α-淀粉酶10 g和0.05%纖維素酶2 g進行酶解處理，調(diào)節(jié)溫度為50℃左右，磁力攪拌24 h，靜置3～4 h［12］。

將上述得到的混合溶液進行離心以完全分離渣和上清液，上清液加入比例為4∶1的氯仿與正丁醇，通過Sevage法［13］除蛋白，機械攪拌靜置離心，重復(fù)3次，合并上清液并過濾濃縮至500 mL。渣先后經(jīng)過0.03%NaBH4溶液和3%NaOH溶液共2 000 mL，0.05%NaBH4溶液和5%NaOH溶液共2 000 mL堿處理后，用醋酸中和，機械攪拌后靜置離心，過濾濃縮分離上清液。用H2O2除色素，透析7 d，濃縮后冷凍干燥得到山藥多糖。

1.2.2 氨取代山藥多糖的制備稱取山藥多糖200 mg，加入0.5 mol/L NaOH溶液40 mL，磁力攪拌至多糖完全溶解。?。?-氯-2-羥丙基）三甲基氯化銨溶液1 mL緩慢加入多糖溶液中，繼續(xù)在80℃水浴鍋中加熱攪拌8 h，透析7 d，濃縮后冷凍干燥得到氨取代山藥多糖。

1.2.3 GC-MS單糖分析甲基化是一種可以測量多糖結(jié)構(gòu)的化學分析方法，可以用于確定多糖中單糖殘基之間的連接位置。以下方法根據(jù)文獻［14］稍作修改。在N2保護下，將2.5 g NaH加入到25 mL DMSO中以獲得甲基化試劑（SMSM），通過在SMSM中使用CH3I將10 mg多糖甲基化3次，然后在去離子水中透析并冷凍干燥。通過FT-IR檢測甲基化多糖是否成功，然后加入2 mol/L三氟乙酸3 mL在120℃下水解6 h。用NaBH4還原部分甲基化的單糖，并用乙酸中和，然后在120℃下用乙酸酐乙?；? h。將樣品用氮氣吹干并溶解在CHCl3中。最后通過0.22μm膜過濾。

GC-MS條件［15］為：色譜柱為HP-5MS型彈性石英毛細管柱（30.0 m×250μm×0.25μm），進樣量為1μL，采用程序升溫，初始溫度為80℃，保持2 min，以5℃/min的速度升溫至240℃，分流比1∶1。氦氣流速為1 mL/min，EI離子源70 eV，接口溫度和離子源溫度分別為200、240℃。

1.2.4 紅外吸收光譜分析用分析天平分別稱量3 mg氨取代山藥多糖樣品和山藥多糖樣品，與一定量的KBr混合均勻壓成薄片，然后用FT-IR光譜儀在4 000～400 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描紅外吸收值［16］。

1.2.5 核磁共振波譜分析用分析天平稱量20 mg山藥多糖樣品，加入0.5 mL的D6-二甲基亞砜，配制成40 mg/mL溶液，在80℃條件下機械攪拌至溶解，靜置后進行1HNMR、13CNMR測定［17］。所有化學位移的單位用ppm表示。

1.2.6 光散射分析分別用分析天平精確稱量15 mg氨取代山藥多糖樣品和山藥多糖樣品。然后加入0.9%NaCl溶液5 mL，80℃下攪拌8 h至溶解。測試溫度25℃，進樣量100μL，流速為0.4 mL/min。流動相為0.02%NaN3和0.2%NaNO3水溶液，用Astra軟件進行數(shù)據(jù)采集和分析［18］。

1.2.7 保潤性能測試稱取煙絲4份，每份20 g放入托盤中，放入恒溫恒濕箱中，控制溫度為22℃，相對偏差在1℃左右，相對濕度為60%，相對偏差在2%左右，在48 h內(nèi)平衡煙草水分。之后分別稱取氨取代山藥多糖樣品和山藥多糖樣品0.02 g溶于1.98 mL的去離子水中，配制2 mL 1%的丙二醇溶液，量取2 mL去離子水，將這4種溶液分別裝入噴壺，均勻地噴灑在煙絲上；放入恒溫恒濕箱中調(diào)節(jié)溫度為22℃，相對偏差在1℃左右，濕度為60%，相對偏差在2%左右，平衡水分。平衡48 h后將托盤取出分別稱量質(zhì)量3次，取平均值記為m0；然后再放回恒溫恒濕箱中，溫度調(diào)為22℃，相對偏差在1℃左右，濕度為40%，相對偏差在2%左右，每隔6 h稱量煙絲質(zhì)量，計為m1，直至煙絲質(zhì)量基本保持不變；然后將煙絲置于烘箱中，調(diào)節(jié)溫度為105℃，烘至煙絲的質(zhì)量基本沒有變化［19］，經(jīng)過冷卻后稱取干煙絲的質(zhì)量記為m。則煙絲的初始含水率（W0）為：

樣品中的煙絲即時含水率（W）為：

以時間為橫坐標，即時含水率為縱坐標制作煙絲的保潤性能圖［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥多糖的單糖分析

通過從山藥中提取山藥多糖，共得到山藥多糖9.2 g，提取率為4.6%。甲基化用于分析單糖組成，由表1可知，在山藥多糖中檢測到糖鏈上殘基類型主要構(gòu)型為→4）-Glcp-（1→、→6）-Glcp-（1→、→6）-Galp-（1→、→3）-Manp-（1→、→2，3）-Manp-（1→和端基Glcp-（1→，除少量甘露糖（9.3%）和半乳糖（4.6%）外，山藥多糖主要由葡萄糖（86.1%）組成。糖鏈主鏈主要由→4）-Glcp-（1→組成，含有少量末端糖基Glcp-（1→，糖鏈支化點應(yīng)為→2，3）-Manp-（1→。

表1 山藥多糖甲基化分析結(jié)果

2.2 紅外光譜分析

在多糖的結(jié)構(gòu)分析中，紅外光譜可以識別多糖官能團，進行定性分析。圖1是山藥多糖及其氨基化修飾后的紅外光譜圖，在波數(shù)3 350 cm-1處有1個較寬的伸縮振動峰，是多糖羥基O-H的伸縮振動峰，C-H鍵在波數(shù)2 820 cm-1附近出現(xiàn)較強的吸收峰。1 700 cm-1處的吸收峰是由羰基C=O伸縮振動引起的。在波數(shù)1 050 cm-1處出現(xiàn)2個強吸收峰，是典型的吡喃糖苷的吸收峰。在波數(shù)1 350～1 500 cm-1區(qū)域的峰可以看出，山藥多糖和氨取代山藥多糖光譜有明顯的差異，其中波數(shù)1 480 cm-1處是羥基與氨基結(jié)合基團的特征吸收峰［8］，這說明氨取代修飾成功。

圖1 傅里葉紅外光譜

2.3 核磁共振波譜分析

核磁共振技術(shù)在研究糖鏈結(jié)構(gòu)中起重要作用，其可以提供諸如單糖構(gòu)型、糖苷鍵和與糖殘基的連接序列之類的信息，為分析多糖結(jié)構(gòu)提供最重要的數(shù)據(jù)?；谖墨I［21］可獲得部分NMR光譜（1H，13CNMR）特征峰的歸屬。山藥多糖的13CNMR如圖2所示，碳的化學位移見表2，在異頭碳區(qū)域，發(fā)現(xiàn)3個異頭碳信號，依次標記為C1、C1′和C1″，其化學位移分別為100.7、97.4和92.5 ppm。由于C4去屏蔽導(dǎo)致其信號向低場移動大約9 ppm（C4信號從70 ppm移動至79 ppm），通過一維核磁初步判斷山藥多糖是α-1，4結(jié)構(gòu)。

表2 山藥多糖峰的化學位移

圖2 山藥多糖的一維核磁碳譜

對所有糖殘基的1H進行歸屬，結(jié)果如圖3所示，在13C譜圖的異頭碳吸收峰中，在100.7 ppm處的峰響應(yīng)值較高，該異頭碳信號所對應(yīng)的異頭氫信號為5.1～5.2 ppm，表明糖殘基為典型的α構(gòu)型，結(jié)合前文“2.1”中分析結(jié)果，證明山藥多糖主鏈化學結(jié)構(gòu)為α-1，4-葡聚糖，與淀粉結(jié)構(gòu)類似。

圖3 山藥多糖的一維核磁氫譜

淀粉是各類植物儲存能量和養(yǎng)分的主要方式，山藥塊莖中含有大量的淀粉。淀粉有直鏈和支鏈淀粉兩大類，直鏈淀粉是D-葡萄糖基以α-（1，4）糖苷鍵連接的多糖鏈，支鏈淀粉分子中除有α-（1，4）糖苷鍵的糖鏈外，還有α-（1，6）糖苷鍵連接的分支。直鏈淀粉遇碘呈藍色，支鏈淀粉遇碘呈紫紅色。將8 g KI溶于100 mL去離子水中，待全部溶解后加入1 g I2，振蕩溶解制成KI-I2溶液，驗證所提山藥多糖是否含有淀粉結(jié)構(gòu)。山藥多糖、提取多糖剩余的山藥渣和標樣淀粉均以相同濃度（0.2 mg/mL）溶于水中，滴加KI-I2溶液后，結(jié)果如圖4所示。標樣淀粉變藍，山藥渣也變藍，顏色略淺，說明山藥渣中含有淀粉結(jié)構(gòu)；而所提山藥多糖仍保持無色透明溶液，結(jié)合單糖分析和核磁的結(jié)果，說明其主鏈一級化學結(jié)構(gòu)雖然類似淀粉，但是其側(cè)鏈和空間結(jié)構(gòu)與淀粉不同。

圖4 淀粉、山藥渣和山藥多糖溶液滴加碘液后的顏色變化

2.4 山藥多糖和氨取代山藥多糖的SEC/MALLS/RI分析

山藥多糖的鏈構(gòu)象采用尺寸排阻色譜（SEC）-多角度光散射（MALLS）-示差折光儀（RI）分析，結(jié)果如圖5所示。根據(jù)山藥多糖經(jīng)SEC色譜柱后不同流出時間的示差和光散射信號圖，把圖分為3個區(qū)域，其中組分1可能為山藥多糖聚集體峰，組分2為多糖峰，組分3為溶劑峰。根據(jù)示差信號統(tǒng)計，聚集體所占質(zhì)量分數(shù)為0.58%，含量較少，但是其粒徑較大，因此光散射信號較強。采用Zimm圖擬合方法處理，得到不同組分的分子大小和均方根旋轉(zhuǎn)半徑，結(jié)果如表3所示。由表3可知，組分1相對分子質(zhì)量超過千萬，與示差檢測器結(jié)果結(jié)合可知，組分1應(yīng)有少量的山藥多糖聚集體。由于多糖具有多羥基結(jié)構(gòu)，分子鏈又較大，因此易發(fā)生分子鏈直接相互纏結(jié)，出現(xiàn)聚集體，因此多糖溶液常出現(xiàn)單體和聚集體共存的情況。另外M w/M n稱為多分散指數(shù)，用于闡明聚合物（如多糖）相對分子質(zhì)量分布的寬度。Mw/M n的值越大，相對分子質(zhì)量分布越寬。山藥多糖多分散指數(shù)接近2，說明其分散程度較低，相對分子質(zhì)量較為均一。

表3 山藥多糖和氨取代山藥多糖的相關(guān)分子參數(shù)

圖5 山藥多糖SEC/MALLS/RI色譜

通過測定不同相對分子質(zhì)量級分的Mw與Rw連續(xù)試驗數(shù)據(jù)點，并建立二者的函數(shù)關(guān)系，即Rw=K Mwα，指數(shù)α與在指定溶劑中大分子的形狀和構(gòu)象相關(guān)，可用于判斷高分子在相應(yīng)溶液中的鏈構(gòu)象，其中l(wèi)ogK為y軸上截距，α為直線斜率，通過計算得出K值為-1.34，α值為0.66，接近0.50～0.60，證明高分子在溶液中呈現(xiàn)無規(guī)線團鏈構(gòu)象。采用SEC/MALLS/RI檢測得到山藥多糖的摩爾質(zhì)量為1.747×105g/mol，遠大于氨取代山藥多糖摩爾質(zhì)量1.115×104g/mol，說明衍生化后，山藥多糖發(fā)生降解。另外經(jīng)過氨基化修飾后，多糖的多分散系數(shù)增加，摩爾質(zhì)量分布變寬，可能是因為氨基化過程中，在NaOH的作用下發(fā)生了不均勻的降解所致。

2.5 保潤性能研究分析

在煙絲中分別添加1%丙二醇溶液、1%氨取代山藥多糖溶液、1%山藥多糖溶液和去離子水，放置恒溫恒濕箱中，測定煙絲的含水率。由圖6可知，丙二醇組的含水率為13.78%，山藥多糖組的含水率為13.77%，氨取代山藥多糖組的含水率為14.05%，去離子水組的含水率為13.62%。當恒溫恒濕箱相對濕度調(diào)為40%時，隨著時間的增加煙絲的含水率逐漸下降，但是丙二醇組和山藥多糖組的含水率均高于去離子水組，24 h后4組煙絲的含水率趨于穩(wěn)定。其中在前6 h內(nèi)4組煙絲含水率下降速率均很快，前18 h丙二醇組煙絲的含水率平均下降速率（0.19%/h）明顯小于氨取代山藥多糖組（0.22%/h）、山藥多糖組（0.23%/h）和去離子水組（0.22%/h）。最后趨于穩(wěn)定時，丙二醇組煙絲的含水率為9.79%，相比于初始含水率下降了3.99個百分點，氨取代山藥多糖組煙絲的含水率略低于丙二醇組，為9.66%，相比于初始含水率下降了4.39個百分點，山藥多糖組煙絲的含水率是9.29%，相比于初始含水率下降了4.48個百分點，煙絲的含水率最低的組是去離子水組，為8.74%，相比于初始含水率下降了4.88個百分點。因此可以得出，相對于去離子水組來說，添加一定濃度的丙二醇溶液和多糖（包括山藥多糖和氨取代山藥多糖）溶液都能在一定程度上減緩水分散發(fā)的速度。糖類之所以具有保潤效果可能是因為其結(jié)構(gòu)中含有親水性的基團羥基，通過與水分子作用產(chǎn)生氫鍵從而具有持水能力，可以捕獲空氣中的水分，還可以減少煙絲中的水分向空氣中的揮發(fā)，因此可以維持煙絲中的水分含量處于穩(wěn)定水平。氨取代山藥多糖的保潤性能優(yōu)于山藥多糖是由于其結(jié)構(gòu)中含有氨基基團，因此吸濕能力強于山藥多糖。但是氨取代多糖和山藥多糖的保潤效果沒有傳統(tǒng)的保潤劑丙二醇好，原因可能是因為丙二醇的吸濕能力更強。

圖6 山藥多糖和氨取代山藥多糖的含水率

3 小結(jié)

通過GC-MS法分析山藥多糖的單糖組成，結(jié)果表明，山藥多糖主要由葡萄糖（86.1%）、甘露糖（9.3%）、半乳糖（7.2%）組成。通過傅里葉紅外分析山藥多糖和氨取代山藥多糖的官能團，表明氨取代修飾成功。用SEC/MALLS/RI分析山藥多糖和氨取代山藥多糖的摩爾質(zhì)量及分子構(gòu)象，結(jié)果表明，山藥多糖的摩爾質(zhì)量為1.747×105g/mol，多分散系數(shù)為2.027，均方根旋轉(zhuǎn)半徑為119.5 nm，表明高分子在溶液中呈現(xiàn)無規(guī)線團鏈構(gòu)象。氨取代山藥多糖的摩爾質(zhì)量為1.115×104g/mol，多分散系數(shù)為3.582。通過核磁共振波譜分析和GC-MS分析，山藥多糖組分主要為α-1，4-葡聚糖。山藥多糖和氨取代山藥多糖均具有一定的保潤性，且氨取代山藥多糖比山藥多糖保潤性更強，但效果略低于丙二醇。