任 韻 柳 寒 朱建方 林寶剛 李路朋 華水金,*

(1 湖州市農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心/湖州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 湖州 313000；2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院作物與核技術利用研究所，浙江 杭州 310021；3 龍巖市永定區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 龍巖 364100)

植物組織糖分的積累受農(nóng)藝措施如施氮量的調(diào)控，而施氮量對糖分積累的影響與作物組織和發(fā)育時期密切相關，如施氮降低了水稻莖鞘[1]、黑麥草葉片[2]、紅菜薹[3]和抽薹期油菜莖稈[4]等非結構性可溶性糖等糖類物質的積累量。前人研究表明，增施氮肥對玉米穗位葉果糖含量影響不大，但能提升蔗糖含量，降低淀粉含量；吐絲前，增施氮肥雖能提高發(fā)育的玉米果穗果糖和葡萄糖含量，但會降低蔗糖和淀粉含量；進入灌漿期，增施氮肥會顯著降低發(fā)育籽粒果糖和葡萄糖含量，但會迅速增加籽粒中淀粉含量，為籽粒積累干物質提供物質基礎，最終達到增產(chǎn)的目的[5]。同時，施用氮肥還能調(diào)節(jié)碳水化物對作物源-流-庫的運轉系統(tǒng)從而影響作物產(chǎn)量。Yan等[6]發(fā)現(xiàn)施用氮肥會降低油用亞麻開花前葉片中的可溶性糖含量，促進莖稈可溶性總糖和淀粉含量，但純施氮肥(以施氮量為0 kg·hm-2為對照)會降低葉片和莖稈中非結構性糖向種子的轉移效率，即降低“流”效率，增加無效蒴果數(shù)量，最終導致產(chǎn)量下降。由此可見，施用氮肥對作物糖分積累的調(diào)控是一個復雜的過程。目前，施氮量對菜薹糖分積累的調(diào)控機制鮮有報道。

油菜薹發(fā)育過程中會積累大量糖分，這些糖分具有多重作用，如增加油菜薹甜度，提升其口感[7-9]，為菜薹增粗和伸長提供能量物質等[10-11]。油菜抽薹是一個動態(tài)過程，糖分也處于合成-同化-運轉的動態(tài)平衡過程，因此，不同株高采摘的油菜薹中糖分含量也可能存在差異。為明確施氮量和采薹株高對油菜薹糖分積累的影響，本研究以油蔬兩用型油菜品系富硒1號為材料，比較不同施氮量和采收株高對油菜薹碳水化合物含量的影響，并分析碳水化合物代謝相關酶活性和關鍵基因的表達量，旨在為油菜薹合理施用氮肥和確定合適的采摘時期提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料和試驗地條件

供試材料為浙江省農(nóng)業(yè)科學院油菜育種與栽培研究室提供的中熟型油蔬兩用型油菜品系富硒1號。浙江地區(qū)菜薹采收期在2月中旬；菜薹產(chǎn)量為450～500 kg·hm-2； 菜薹硒含量為12～15 μg·kg-1(鮮重)。試驗在浙江省杭州市余杭良渚麟海蔬果專業(yè)合作社開展。前茬作物為水稻，土壤主要養(yǎng)分含量為：全氮 635.0 mg·kg-1、 速效磷 74.5 mg·kg-1、速效鉀99.2 μg·kg-1。 試驗于2018年10月5日播種，穴直播，每穴播種5粒種子左右。幼苗達到三葉一心時間苗1次，五葉期時定苗。油菜生長期內(nèi)水分、病蟲害管理同常規(guī)。

1.2 試驗設計與實施(含采樣制樣)

采用裂區(qū)試驗設計，主處理為3個施氮量：施用純氮120、180和240 kg·hm-2(分別以N1、N2和N3表示)；副處理為4個菜薹采收株高：株高20、30、40和50 cm(分別以H1、H2、H3和H4表示)。試驗設置3次重復。小區(qū)面積13 m2，種植密度為120 000株·hm-2。 氮肥(尿素)按照純氮量進行折算施用量，分3次均勻施入土壤：60%作為基肥，10%作為提苗肥(五葉期)，30%作為薹肥；磷肥(過磷酸鈣，870 kg·hm-2)、 鉀肥(氯化鉀，200 kg·hm-2)和硼肥(硼砂，15 kg·hm-2)作為基肥一次性施入土壤中。

土壤取樣：油菜地翻耕前采用“S”形法取土樣用于養(yǎng)分檢測。菜薹采樣標準：當小區(qū)75%的植株達到采樣株高時，每小區(qū)隨機選擇60株油蔬兩用型油菜(小區(qū)邊界植株除外)，從花蕾頂部往下切取10 cm長的菜薹。采摘的菜薹分兩部分，一部分置于裝有碎冰塊的保溫泡沫盒，立即運回油菜育種與栽培實驗室，進行糖分檢測。另一部分油菜薹立即置于液氮中冷凍后運回實驗室，并于-80℃超低溫冰箱保存，用于酶活性檢測和基因表達分析。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤養(yǎng)分含量測定 土壤全氮采用凱氏定氮法測定；速效磷采用鉬銻抗比色法；速效鉀采用火焰光度計法[12]。

1.3.2 可溶性糖組分測定 果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉含量采用蒽酮比色法[13-14]，海藻糖和山梨醇含量采用試劑盒檢測(HT-2-Y和SC-2-Y，蘇州科銘生物技術有限公司)。

1.3.3 可溶性糖代謝相關酶活性測定 轉化酶(invertase，INV)、蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)活性分別按照文獻[15-17]所述方法測定。

1.3.4 蔗糖和淀粉代謝途徑關鍵基因表達分析 選擇蔗糖和淀粉代謝途徑中關鍵基因進行表達量分析。蔗糖和淀粉代謝關鍵基因的序列在油菜基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中查找，然后設計引物，引物序列見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。油菜薹RNA提取、反轉錄以及實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)按照文獻[18]的方法進行。以油菜ACTIN作為參考基因，采用2-ΔΔCt方法[19]進行基因相對表達量計算。比較不同施氮量對油菜薹蔗糖和淀粉代謝關鍵基因表達量時，以120 kg·hm-2處理下油菜薹基因表達量作為對照(即以120 kg·hm-2處理下油菜薹基因表達量為1，其余氮肥處理下油菜薹基因表達量相對于120 kg·hm-2處理下油菜薹基因表達量的倍數(shù))；比較不同采收株高油菜薹蔗糖和淀粉代謝關鍵基因表達量時，以株高20 cm處理下油菜薹基因表達量為對照。

表1 油菜薹蔗糖和淀粉代謝關鍵基因qRT-PCR分析引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR analysis of sucrose and starch metabolism in rapeseed

1.4 統(tǒng)計分析

試驗中不同氮肥和采收株高處理下油菜薹的果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、海藻糖、山梨醇含量，INV、SS、SPS活性以及編碼碳水化合物代謝關鍵酶基因的表達量均采用平均值計量。統(tǒng)計分析時以施氮量為主處理，采收株高為副處理，通過裂區(qū)試驗設計方法進行方差分析。各平均值之間的差異采用Duncan’s法分析。基因表達采用R語言軟件包進行熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 施氮量和采收株高對油菜薹糖分含量的影響

不同施氮量和采收株高對油菜薹糖分含量的影響見表2。就不同施氮量對油菜薹糖分含量的影響而言，淀粉平均含量隨著施氮量的增加而降低，其余糖分平均含量則隨著施氮量的增加先升高后降低。果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖和山梨醇平均含量在施氮量為180 kg·hm-2時較施氮量120 kg·hm-2處理分別增加了16.19%、27.61%、18.52%、45.91%和43.25%，較施氮量240 kg·hm-2處理分別增加了15.09%、10.22%、33.33%、28.89%和61.40%。表明油菜薹施氮量不宜超過180 kg·hm-2，在此范圍內(nèi)，施氮量對油菜薹糖分含量(淀粉除外)具有促進作用，而超過此范圍則對油菜薹碳水化合物含量的積累具有一定的抑制作用。

就不同采收株高對油菜薹糖分含量而言，在3個施氮量處理下，果糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉含量分別在采收株高20 cm時最高(除果糖含量在施氮量240 kg·hm-2處理下，采收株高50 cm時最高)；在采收株高30～50 cm時，這4種糖分含量總體趨勢表現(xiàn)為隨著采收株高的增加而增加，但未能恢復到采收株高20 cm處理下的含量。海藻糖和山梨醇含量均表現(xiàn)為采收株高40 cm時最高，其他采收株高下這2種糖含量差異較小。

表2 不同施氮量和采收株高對油菜薹糖分含量的影響Table 2 Effects of nitrogen application rates and plant height during harvesting on the contents of carbohydrate in young stem of rapeseed /(mg·g-1 FW)

2.2 施氮量和采收株高對菜薹碳水化合物代謝關鍵酶活性的影響

由圖1-A可知，INV活性在采收株高20 cm的菜薹中隨施氮量的增加而增加，兩者的相關系數(shù)達到0.999。在采收株高30和40 cm時，菜薹中的INV活性均隨施氮量的增加而降低。在采收株高50 cm時，菜薹中INV活性隨施氮量的增加先減后增。在采收株高40 cm、施氮量120 kg·hm-2處理下菜薹中的INV活性達到最高，但當施肥量增加至180 kg·hm-2時，該酶活性降低了52.25%。

由圖1-B可知，SS活性在采收株高20 cm的菜薹中隨施氮量的增加而降低，兩者相關系數(shù)達到了-0.988。 在采收株高30 cm的菜薹中，施氮量從120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2時，SS活性快速降低，降幅達到49.08%；而施氮量從180 kg·hm-2增加至240 kg·hm-2時，酶活性略有增加。在采收株高40 cm的菜薹中，SS活性隨著施氮量的增加表現(xiàn)為先增后減，其增加和減少幅度分別為21.64%和4.91%。采收株高50 cm的菜薹中SS活性隨施氮量的增加而增加，兩者相關系數(shù)達到0.961，但該時期采收的菜薹中SS活性總體最弱。

由圖1-C可知，在采收株高20和30 cm時，施氮量從120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2后，油菜薹中的SPS活性分別增加了2.52和3.93倍；但施氮量從180 kg·hm-2增加至240 kg·hm-2后，SPS活性分別降低了57.41%和30.90%。在采收株高40 cm時，菜薹中SPS活性隨施氮量的增加而降低，兩者相關系數(shù)達到了-0.992；其活性較其他3個采收時期弱。在采收株高50 cm時，菜薹中SPS活性隨施氮量的增加而增強，兩者的相關系數(shù)達到了0.980，在施氮量240 kg·hm-2處理下，SPS活性是施氮量120 kg·hm-2處理的1.94倍。

圖1 不同施氮量和采收株高對 INV、SS和SPS活性的影響Fig.1 Effects of nitrogen rates and harvesting plant heights on the activities of INV, SS and SPS

2.3 施氮量和采收株高對菜薹碳水化合物代謝關鍵基因表達量的影響

2.3.1 以施氮量120 kg·hm-2為對照處理 由圖2可知，在采收株高20和30 cm時，施氮量對催化蔗糖合成的SPS1/SPS2基因的表達量無影響；在采收株高40 cm時，氮肥促進了該基因的表達，在施氮量180和240 kg·hm-2處理下，該基因的上調(diào)量分別達到了3.13和2.14倍；在采收株高50 cm時，施氮量降低了該基因的表達量，下調(diào)量分別達到了1.94和4.39倍。

催化蔗糖分解的轉化酶系統(tǒng)中A/N-INVA基因的表達僅在采收株高40 cm、施氮量180 kg·hm-2處理下表現(xiàn)為較明顯上調(diào)；CINV1基因在采收株高30 cm時的施氮量180 和240 kg·hm-2處理以及采收株高40 cm、施氮量240 kg·hm-2處理下正向表達，且表達量較高，分別是施氮量120 kg·hm-2處理的3.47、3.05和4.68倍；CINV2基因較為活躍，在采收株高20和40 cm、施氮量180 和240 kg·hm-2處理以及采收株高30 cm、施氮量180 kg·hm-2處理時該基因正向表達，且上調(diào)量明顯。在采收株高50 cm時，施氮量對該基因具有下調(diào)作用。

催化蔗糖分解的蔗糖合成酶系統(tǒng)中，在采收株高20和30 cm時，施氮量對SUS1/SUS4基因具有強烈的促進作用，是施氮量120 kg·hm-2的2.35～10.37倍；在采收株高40 cm以上時，施氮量對該基因起負向調(diào)控作用。在采收株高20 cm時，施氮量對SUS3基因的表達具有下調(diào)作用；但在采收株高30 cm以上時，施氮量會促進該基因的表達，尤其在采收株高30 cm、施氮量180 kg·hm-2處理下，比施氮量120 kg·hm-2處理的表達量增加了9.61倍。

ADG1基因在采收株高30 cm時，施氮量180和240 kg·hm-2處理下呈現(xiàn)強烈的正向表達，施氮量180 kg·hm-2處理下ADG1的表達量最高，是施氮量120和240 kg·hm-2處理的13.30倍和2.14倍。ADG2基因的表達量在采收株高40 cm、施氮量240 kg·hm-2處理下非常低，比施氮量120 kg·hm-2處理下調(diào)了20倍以上。

注：紅色代表上調(diào)，藍色代表下調(diào)。下同。以施氮量120 kg·hm-2為對照。Note: Red box represented up regulation and blue box represented down regulation. The same as following. The control was nitrogen application rate at 120 kg·hm-2.圖2 不同施氮量和采收株高對菜薹糖代謝相關基因表達量變化Fig.2 The expression amounts of genes encoding carbohydrate metabolism enzymes under different nitrogen application rates and harvesting plant height in young rapeseed stem

注：以株高20 cm為對照。Note: The control was plant height at 20 cm.圖3 不同施氮量和采收株高對菜薹糖代謝相關基因表達量變化Fig.3 The expression amounts of genes encoding carbohydrate metabolism enzymes under different nitrogen application rates and harvesting plant height in young rapeseed stem

2.3.2 以采收株高20 cm為對照處理A/N-INVA基因的表達量受采收株高影響較小，其上調(diào)和下調(diào)量均在2倍以內(nèi)。CINV1基因表達量在施氮量120和180 kg·hm-2處理下各株高采收時主要表現(xiàn)為下調(diào)；在施氮量240 kg·hm-2處理下各株高采收時均表現(xiàn)為上調(diào)，且在采收株高40 cm時，該基因的上調(diào)量最大，是采收株高20 cm處理的7.34倍。CINV2基因在采收株高50 cm時的所有施氮量處理中均表現(xiàn)為下調(diào)。采收株高30和40 cm、施氮量180 kg·hm-2處理下，該基因表現(xiàn)為上調(diào)；而在120和240 kg·hm-2處理下，其表達量很低。

SUS1/SUS4和SUS3基因除在施氮量240 kg·hm-2、 采收株高30 cm時，同時呈現(xiàn)很高的表達量，其他采收株高和施氮量處理下表現(xiàn)出較強互補性，即SUS1/SUS4基因表達強時，SUS3基因表達較弱，反之亦然。SPS1/SPS2基因的表達量整體較弱，僅在施氮量120 kg·hm-2、 采收株高50 cm與施氮量180 kg·hm-2、 采收株高30和40 cm時表現(xiàn)為上調(diào)。

ADG1基因在不同采收株高和施氮量處理下以下調(diào)為主，且在施氮量240 kg·hm-2、株高50cm采收時，該基因的下調(diào)量最大，比采收株高20 cm的菜薹降低了12.53倍。ADG2基因在不同采收株高和施氮量處理下均為上調(diào)模式。在施氮量120、180和240 kg·hm-2處理下，ADG2基因的表達量隨采收株高增加分別表現(xiàn)為增加，降低以及先增加后降低。在施氮量180 kg·hm-2、采收株高30 cm處理下，ADG2基因的表達量最高，是采收株高20 cm的13.48倍。

3 討論

前人研究表明，施氮量在適宜范圍內(nèi)能夠促進作物組織多種糖類物質的積累[20-21]。本試驗中，施氮量從120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2，油菜薹果糖、葡萄糖、山梨醇、海藻糖和蔗糖等糖類物質含量增加。油菜薹采摘時處于抽薹初期，該時期油菜對氮肥需求旺盛[22-23]。增施氮肥能夠促進油菜葉片等綠色組織光合作用，增強光合產(chǎn)物在葉片和莖稈(包括油菜薹)等綠色組織中的積累[24-25]。然而，并非所有糖類物質都受到氮素的促進作用，如本研究中隨著施氮量的增加，菜薹淀粉含量降低。在不同作物中，施氮量對淀粉含量的影響不盡相同。如提升施氮量能夠顯著提高葡萄幼苗葉片[26]和小麥籽粒[27]的淀粉含量，卻降低了水稻籽粒[28]直鏈淀粉含量。這也反映出作物器官淀粉含量對施氮量的反饋可能受到作物種類和器官的影響。本研究中，當施氮量進一步增加至240 kg·hm-2時，糖類物質積累均受到了抑制。過量氮肥抑制植物組織糖類物質的積累的現(xiàn)象已有較多研究報道[29-30]。劉娜等[31]指出，較高的施氮量不利于甜菜糖分積累。溫志靜等[32]研究發(fā)現(xiàn)過量氮肥施用導致嘎啦蘋果果糖、葡萄糖和蔗糖合成受到抑制，從而影響品質。這些結果說明，高氮肥在提高作物產(chǎn)量和品質上并無預期效應，還有造成肥料浪費、增加生產(chǎn)成本的風險。因此，適宜范圍的施肥量是提高作物品質的關鍵因素之一。

蔗糖是作物重要的光合產(chǎn)物。與蔗糖代謝相關的酶類主要有SPS、SS和INV，其中SPS活性能反映植物體內(nèi)蔗糖合成能力，SS和INV活性則體現(xiàn)蔗糖分解能力[33-35]。本研究中，在采收株高20 cm下，施氮量從120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2時，菜薹中的SPS活性增強。氮肥促進SPS活性，有利于光合產(chǎn)物的積累。但菜薹中的蔗糖含量隨施氮量的增加而降低，可能與葉片中的蔗糖向菜薹的分配效率有關。在氮肥較少的情況下，葉片中合成的光合產(chǎn)物可能提前向菜薹輸送，因此檢測到了較高的蔗糖含量；施氮量增多時，氮肥促進油菜生物量的積累，但此時薹莖較短，莖稈長度和生物量均較小(以最終株高160 cm計算，其高度僅占12.5%)，仍以葉片生長為重心，因此，氮肥促進植株光合作用，合成的光合產(chǎn)物仍主要停留在葉片，分配至菜薹的量不多，導致菜薹中檢測到的蔗糖含量減少。當施氮量超過180 kg·hm-2時，過高的氮肥對SPS活性具有一定的抑制作用，影響了菜薹蔗糖的積累。該現(xiàn)象在其他作物中也有報道[36]。由蔗糖分解的兩種酶系統(tǒng)活性可知，INV和SS活性對氮肥響應的趨勢相反，在不同施氮量下，兩種酶分解蔗糖的活性此消彼長，但對蔗糖的分解起到了相互補償?shù)淖饔?，這也可能是該階段油菜薹蔗糖隨施氮量增加而降低的原因。隨著采收株高的增加，菜薹中的蔗糖含量在各氮肥處理下均遠低于采收株高20 cm的菜薹，這可能是由于隨著莖稈的伸長，菜薹中大量蔗糖被分解成單糖(如葡萄糖等)運輸至菜薹頂部的花蕾供其發(fā)育。在各氮肥處理下，采收株高30 cm以上的菜薹中，SPS活性明顯低于INV和SS，這也說明此時菜薹中蔗糖的分解能力強于合成能力，導致蔗糖含量降低。

本研究從基因表達水平層面剖析氮肥和采收株高對油菜薹糖分積累的影響，結果發(fā)現(xiàn)編碼SPS基因SPS1/SPS2的表達量在各施氮量處理下采收株高20～30 cm的菜薹中的表達量很低，說明SPS基因在該階段菜薹中合成蔗糖的能力并不強，其蔗糖的可能來源主要是其他葉片的運輸。采收株高40和50 cm時，SPS1/SPS2的表達量在施氮量240 kg·hm-2處理下比施氮量180 kg·hm-2處理低，說明在高施氮量下SPS1/SPS2的表達量受到了一定的抑制，進而使菜薹中的蔗糖積累受到一定程度的抑制。

4 結論

本研究結果表明，油菜薹中果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖和山梨醇含量隨施氮量的增加而增加，施氮量超過180 kg ·hm-2后則降低。就不同采收株高而言，菜薹中果糖、淀粉、葡萄糖和蔗糖含量在采收株高20 cm時最高；海藻糖和山梨醇含量在采收株高40 cm時顯著高于其他株高采收菜薹處理。菜薹中蔗糖合成代謝系統(tǒng)的SPS活性在各施氮量和株高處理下比蔗糖分解代謝系統(tǒng)的INV和SS活性低。在菜薹各采收時期和施氮量處理下，蔗糖分解體系的蔗糖合成酶SUS1/SUS4、SUS3和轉化酶A/N-INVA、CINV1、CINV2等基因的上調(diào)模式具有互補性，而對蔗糖合成體系的蔗糖磷酸合成酶SPS1/SPS2基因的表達量影響較小。