張元博 田嬌嬌 葉凌志 葉正威 張 琳,3,* 徐繼林,3,*

(1 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2 浙江省海洋生物工程重點實驗室(寧波大學(xué))，浙江 寧波 315211；3 浙江省海洋生物技術(shù)重點實驗室(寧波大學(xué))，浙江 寧波 315211)

作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，微藻富含糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸和色素等營養(yǎng)物質(zhì)，且光合效率高、繁殖速度快，被廣泛用作水產(chǎn)動物餌料[1-3]。許多微藻代謝產(chǎn)物具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。其中，二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)可提高脂肪細胞線粒體氧化能力，在一定程度上避免氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]； β-胡蘿卜素能清除水產(chǎn)動物體內(nèi)的活性氧，提高機體免疫力[5]；蝦青素能夠使甲殼類、魚類保持健康體色，提高其觀賞和經(jīng)濟價值[6]；從橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea)中提取的紫黃素具有一定的抗炎活性[7]。同時，微藻還可為幼魚生長提供優(yōu)質(zhì)蛋白，并能促進雙殼貝類生長[8]。

餌料微藻營養(yǎng)物質(zhì)積累受多種環(huán)境因子影響，如光強、光質(zhì)、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽等[9-10]。據(jù)報道，300 μmol photons·m-2·s-1光強能顯著提高缺刻緣綠藻(Parietochlorisincisa)的生物量并促進其脂肪酸積累[11]，而50 μmol photons·m-2·s-1光強比210 μmol photons·m-2·s-1光強更能促進普通小球藻(Chlorellavulgaris)生長[12]。紅(80%)、藍(20%)光混合照射可促進螺旋藻(Spirulinasp.)生長，并顯著提高其葉綠素a、藻藍素和類胡蘿卜素含量[13]。類似地，LED白藍混合光照射可大大提高普通小球藻的生物量[14]。而171 μmol photons·m-2·s-1純藍光比混合白光更能促進湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)光合作用[15]。此外，在一定范圍內(nèi)(10～30 mg·L-1)增加氮濃度可提高鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)比生長速率、生物量、蛋白和可溶性糖含量，而氮濃度過高(40 mg·L-1)則會抑制其生長[16]。在氮充足條件下，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)對氮源的吸收效率受磷濃度影響，且在藍光輔助照射下對磷吸收效率最高，達90.80%[17]。可見，不同環(huán)境因子間可相互影響，共同作用于微藻生長和代謝，光和營養(yǎng)鹽是其中重要的環(huán)境因子，頗具研究意義。

微擬球藻(Nannochloropsissp.)是一類分布廣泛的單細胞微藻，既有海水種也有淡水種[18]，個體微小，生長迅速，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域[19]。微擬球藻富含油酸、亞油酸、EPA等多不飽和脂肪酸，其中，EPA含量最高可達總脂肪酸的30%[20]。此外，微擬球藻色素組成十分獨特，只含有葉綠素a，不含葉綠素b和葉綠素c[21]，富含β-胡蘿卜素、角黃素、葉黃素、紫黃素和無隔藻黃素等，一些微擬球藻還能積累蝦青素[22]?？扇苄蕴呛偷鞍鬃鳛槲M球藻中最豐富的有機成分，占細胞干重比重較大，其中蛋白含量最高可達30%[23]。

環(huán)境因子對微擬球藻營養(yǎng)組成的影響已有部分報道。當(dāng)?shù)?、磷、鐵的濃度分別為24.6、1.1和0.2 mg·L-1時，微擬球藻可獲得最高生物量和蛋白含量[24]。Sung等[23]比較了相同光強的白光、紅光和藍光對微擬球藻的影響，發(fā)現(xiàn)在紅、藍光下其生物量積累分別提高40.3%、35.1%。相較于150 μmol photons·m-2·s-1光強，微擬球藻在50 μmol photons·m-2·s-1光強下能獲得更高的生物量和脂肪酸(尤其是EPA)產(chǎn)量[25]。研究表明，相同培養(yǎng)條件下，高生物量與高營養(yǎng)物質(zhì)積累往往不能兼得，需采用“兩階段培養(yǎng)法”：第一階段為微擬球藻提供最適生長條件，短期內(nèi)獲得更多生物量；第二階段將擴繁后的微擬球藻轉(zhuǎn)移至目標(biāo)營養(yǎng)物質(zhì)最適積累條件下培養(yǎng)，優(yōu)化營養(yǎng)組成，提高目標(biāo)營養(yǎng)占比[26]。通過調(diào)控環(huán)境因子，使微擬球藻短期內(nèi)獲得最大生物量進而積累更多目標(biāo)營養(yǎng)物質(zhì)，可大大促進微擬球藻在餌料領(lǐng)域的應(yīng)用，是現(xiàn)階段研究的重要方向之一。

基于此，本試驗系統(tǒng)分析了4種不同環(huán)境因子(光質(zhì)、光強、氮、磷)對微擬球藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，分析其生長最適環(huán)境因子與營養(yǎng)物質(zhì)積累最佳因子，旨在為后續(xù)大規(guī)模培養(yǎng)微擬球藻提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗藻種選取海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)，由浙江省海洋生物工程重點實驗室提供，編號NMBluh014。藻種培養(yǎng)選用高壓滅菌(121℃、20 min)后的NMB3#培養(yǎng)基[27]。培養(yǎng)溫度25℃，光強80 μmol photons·m-2·s-1，光暗比12 h∶12 h。每天搖瓶數(shù)次，防止藻細胞貼壁。

1.2 試驗方法

試驗分為光質(zhì)、光強、氮濃度和磷濃度梯度試驗四部分。所有試驗組微擬球藻初始接種密度統(tǒng)一，并同時采用細胞計數(shù)法與紫外分光光度計法(OD值)在波長750 nm處測定藻細胞密度(2±0.5×106cell·mL-1；OD750=0.050±0.003)。除所設(shè)環(huán)境因子變量外，其余環(huán)境因子保持一致，隔天測定OD750。培養(yǎng)25 d后取5 mL藻液進行色素分析，離心(8 000 r·min-1，10 min)收集藻細胞，冷凍干燥48 h后測定脂肪酸、可溶性糖及蛋白含量。每組設(shè)置3個平行。

1.2.1 光質(zhì)試驗方法 使用N600H2-S-K06-06可調(diào)式液冷復(fù)合光譜試驗燈組(廈門三安光電有限公司)，調(diào)節(jié)不同試驗組中紅、藍、綠光分別占比為100%、50%、0%，并依據(jù)RGB三原色原理(Red∶Green∶Blue=2∶1∶1)[28]將剩余比例單色光補齊(表1)。

表1 不同試驗組光質(zhì)組成Table 1 Light quality composition of different experimental groups

1.2.2 光強試驗方法 微擬球藻培養(yǎng)在恒溫GXZ-280B光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)內(nèi)完成。設(shè)置光強分別為20、80、140和200 μmol photons·m-2·s-1，編號L1～L4。

1.2.3 氮濃度、磷濃度試驗方法 以NMB3#培養(yǎng)基氮、磷工作濃度(氮13.85 mg·L-1、磷2.24 mg·L-1)為對照。設(shè)置氮元素55.40、13.85、3.46、1.73 mg·L-14個梯度(編號N1～N4)，磷元素8.96、2.24、0.56、0.28 mg·L-14個梯度(編號P1～P4)，梯度設(shè)置基于預(yù)試驗結(jié)果，其余營養(yǎng)鹽濃度保持不變。其中，N2與常規(guī)NMB3#培養(yǎng)基中氮濃度一致，且其余環(huán)境因子均相同，因此將N2視為常規(guī)對照組。

1.2.4 脂肪酸組成測定方法 藻粉冷凍干燥后置于10 mL玻璃試管中，加入HPLC級正己烷1 mL和甲酰氯1.5 mL(甲醇∶乙酰氯=10∶1)，漩渦震蕩30 s，65℃水浴2.5 h，加入6%碳酸鉀2.5 mL、正己烷1 mL，漩渦震蕩30 s，取上清液至2 mL EP管中，3 000 r·min-1離心10 min，用0.22 μm針式有機相濾膜過濾至2 mL棕色進樣瓶，使用7890B/7000C三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜分析儀(美國安捷倫科技有限公司)進行脂肪酸組成分析，采用面積歸一化法計算相對百分含量。

1.2.5 色素組成測定方法 色素提取操作嚴(yán)格避光。取5 mL藻液，用47 mm GF/F玻璃纖維濾膜真空抽濾，剪碎濾膜至15 mL離心管中，加入HPLC級甲醇5 mL，渦旋震蕩5 min，冰浴超聲20 min后用0.22 μm有機相針式過濾器(直徑13 mm)過濾上清液去除雜質(zhì)，2 mL棕色進樣瓶收集濾液，使用HPLC-Q-Orbitrap超高液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(美國賽默飛世爾科技公司)進行色素組成分析，采用面積歸一化法計算相對百分含量。

1.2.6 蛋白和可溶性糖含量測定方法 采用蒽酮-硫酸比色法測定可溶性糖含量，考馬斯亮藍法測定蛋白含量，測定使用對應(yīng)濃度試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)，步驟謹(jǐn)遵說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與制圖。使用SPSS 20軟件進行單因素方差分析及差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境因子下微擬球藻生長

注：A：7 d時各試驗組OD值；B：15 d時各試驗組OD值；C：23 d時各試驗組OD值；L1～L4分別表示光強20、80、140和200 μmol photons·m-2·s-1； N1～N4分別表示氮濃度55.40、13.85、3.46、1.73 mg·L-1；P1～P4分別表示磷濃度8.96、2.24、0.56、0.28 mg·L-1；不 同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A: OD value of each experimental group at 7 d. B: OD value of each experimental group at 15 d. C: OD value of each experimental group at 23 d. L1～L4 represent the light intensity 20, 80, 140, 200 μmol photons·m-2·s-1, respectively. N1～N4 represent nitrogen concentration of 55.40, 13.85, 3.46, 1.73 mg·L-1, respectively. P1～P4 represent phosphorus Concentration 8.96, 2.24, 0.56, 0.28 mg·L-1, respectively. Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.圖1 不同時間點不同環(huán)境因子下微擬球藻生長Fig.1 Growth of N. oceanica with different environmental factors at different time points

圖1為微擬球藻在不同環(huán)境因子下的生長情況，選取時間點分別為指數(shù)期(7 d)、平臺初期(15 d)和平臺末期(23 d)，7 d時，綠光G2組生長最為緩慢，并與紅、藍光組存在顯著性差異(P<0.05)。氮濃度試驗組中，N1組生長速度最快，N3、N4生長較為緩慢。培養(yǎng)7～15 d時，隨著氮、磷的缺乏，N3、N4和P4組生長速率變慢，與之相比，其他試驗組生物量積累均穩(wěn)步提高，15 d時，L4組生長最為迅速。培養(yǎng)至23 d，L4組獲得最大生物量。氮、磷試驗組生長情況與營養(yǎng)鹽濃度呈正相關(guān)，N1和P1組生物量積累較大，N4組生物量最少。光質(zhì)試驗中，R1組生物量積累較大，并與其他光質(zhì)試驗組存在顯著性差異(P<0.05)。值得注意的是，所有光質(zhì)比例下微擬球藻均可保持健康生長，預(yù)示著微擬球藻光譜適應(yīng)性較廣。純紅光或氮富足條件下指數(shù)期微擬球藻生長增速較大，更高的光強對于微擬球藻在指數(shù)末期至平臺期生長增速較大。

2.2 不同環(huán)境因子對微擬球藻脂肪酸組成影響

不同環(huán)境因子下微擬球藻脂肪酸組成見表2。共檢出二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)、花生四烯酸(C20:4n-6)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亞油酸(C18:2n-6)、棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:1)和肉豆蔻酸(C14:0)8種脂肪酸，其中飽和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)3種，占比為31.767%～58.436%，不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid, UFA)5種，占比為41.564%～68.233%。

光強試驗中，光強在80～200 μmol photons·m-2·s-1范圍內(nèi)時，SFA比例隨光強增強呈上升趨勢，UFA比例則逐漸下降。除C14：0在L1與L3組存在顯著性差異外，其余脂肪酸組分在不同光強下差異均不顯著。光質(zhì)試驗中，EPA的積累量隨著紅光比例的的下降而增大，隨著藍光比例下降而減少，SFA與UFA則未呈現(xiàn)明顯的變化趨勢。整體來看，單色光和光強對微擬球藻脂肪酸組成影響不大。

相較于光質(zhì)和光強，氮、磷濃度變化對脂肪酸積累影響更大。氮濃度試驗中，隨著氮濃度降低，SFA比例呈上升趨勢，UFA比例則逐漸下降。N1組UFA比例達到最大值，為68.233%，EPA積累也達到最大值20.502%。N4組SFA比例達到最大，為58.436%，而UFA最低，為41.564%，說明氮元素的缺乏是導(dǎo)致微擬球藻UFA比例下降的主要原因。磷濃度試驗中，隨著磷濃度降低，SFA比例先下降后上升，UFA比例先上升后下降，推測微擬球藻UFA最適積累磷濃度為2.24 mg·L-1，C14：0和C18：0在P1組中分別達到最大積累量4.398%和7.941%，C20：4n-6在P2組積累量最大，為3.368%。

2.3 不同環(huán)境因子對微擬球藻色素組成影響

微擬球藻中共檢出11種色素，分別是葉綠素a、β-胡蘿卜素、角黃素、硅甲藻黃素、葉黃素、玉米黃素、蝦青素、紫黃素、隱藻黃素、異黃素和百合黃素。其中葉綠素a和β-胡蘿卜素占比最大，非脅迫狀態(tài)下兩者含量之和可達總含量的70%。

由表3可知，隨著光強的增加，葉綠素a和蝦青素占比逐漸降低，β-胡蘿卜素、玉米黃素占比逐漸增大。在L1中，葉綠素a占比達到全試驗組最大，為55.114%，β-胡蘿卜素占比最小，為23.889%，整體來看，弱光有利于微擬球藻積累葉綠素。

與光強試驗不同，光質(zhì)試驗中β-胡蘿卜素在G1組占比最大(48.281%)，葉綠素a在G1組占比最小(18.962%)，表明綠光有利于微擬球藻積累β-胡蘿卜素。百合黃素在B3組占比最大(4.282%)，在其余試驗組內(nèi)則無顯著性差異。整體來看，光質(zhì)和光強對微擬球藻中高含量色素的影響較大，如葉綠素a和β-胡蘿卜素，對微量色素的影響相對較小。

氮、磷試驗組中，隨著氮濃度降低，葉綠素a占比逐漸增大，β-胡蘿卜素、異黃素和百合黃素占比逐漸降低，在N4組中，蝦青素、角黃素和玉米黃素占比最大，分別為6.280%、10.557%和5.665%。隨著磷濃度降低，角黃素、硅甲藻黃素、紫黃素和隱藻黃素占比逐漸降低，硅甲藻黃素、葉黃素、紫黃素和隱藻黃素在P1組占比最大，分別為3.556%、11.932%、2.340%和6.658%，可見絕大多數(shù)類胡蘿卜素積累的極值均出現(xiàn)在氮、磷脅迫試驗組，表明相較于光質(zhì)和光強，氮、磷濃度對微擬球藻中微量類胡蘿卜素積累的影響更大。

2.4 不同環(huán)境因子對微擬球藻可溶性糖和蛋白含量影響

由圖2可知，隨著光強增加，微擬球藻中可溶性糖和蛋白含量均逐漸增大，可溶性糖和蛋白含量在L4組中達到最大值，分別為5.17 mg·mL-1和2.40 mg·L-1。 氮濃度試驗中，隨著氮濃度降低，可溶性糖和蛋白含量均有所降低(P<0.05)。類似地，在磷濃度試驗中，隨著磷濃度降低，細胞中蛋白含量逐漸下降，而可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在磷2.24 mg·L-1時達到峰值，表明該濃度或許為其積累可溶性糖的最佳濃度。光質(zhì)試驗組中，R3組蛋白含量較其余所有光質(zhì)組顯著升高，G1組蛋白含量較其余所有光質(zhì)組顯著下降(P<0.05)，B1組可溶性糖含量最低，可見，強烈的光照對可溶性糖和蛋白積累的影響遠大于其他環(huán)境因子，強光能促進微擬球藻細胞中可溶性糖和蛋白的積累，而氮濃度的降低則會抑制其積累。同樣，純綠光亦會抑制蛋白積累。

3 討論

3.1 不同環(huán)境因子對微擬球藻生長的影響

微擬球藻生長不僅可以利用二氧化碳、無機氮等無機物，還可以利用葡萄糖、醋酸等有機物，同時還受營養(yǎng)鹽濃度、接種密度、溫度、光照等多種環(huán)境因子影響[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，光照強度對微擬球藻生長影響較為明顯，在20 μmol photons·m-2·s-1光強下，微擬球藻在指數(shù)期生長較為緩慢，平臺期則迅速增長，200 μmol photons·m-2·s-1光強下生長速度始終最快，且最終生物量最高。光質(zhì)試驗中，微擬球藻在純紅光下生長速度最快，且表現(xiàn)出較廣的光譜適應(yīng)性。據(jù)報道，相比于其他光質(zhì)條件，微擬球藻在100 μmol photons·m-2·s-1藍光下有更多的生物量積累[31]，這與本研究結(jié)果不同，由此推測更高的光強可能會提高微擬球藻對于藍光的利用率。氮、磷濃度試驗中，N1與N4、P1與P4生長差異顯著。氮濃度試驗中，N1組生長速度最快，表明足量的氮源有利于微擬球藻在指數(shù)期積累生物量。培養(yǎng)至平臺期時，N4、P4組由于氮、磷的缺乏導(dǎo)致其生長速度變慢，且與其他試驗組生物量積累出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)?？梢?，氮磷的缺乏是導(dǎo)致微擬球藻生物量積累匱乏的最主要原因。

表2 不同環(huán)境因子對微擬球藻脂肪酸組成影響Table 2 The influence of different environmental factors on the fatty acid composition of N. oceanica /%

表3 不同環(huán)境因子對微擬球藻色素組成影響Table 3 The influence of different environmental factors on the pigment composition of N. oceanica /%

圖2 不同環(huán)境因子對微擬球藻可溶性糖和蛋白含量影響Fig.2 The influence of different environmental factors on the soluble sugar and protein content of N. oceanica

以上結(jié)果為微擬球藻培養(yǎng)提供了新思路，可采用指數(shù)期供應(yīng)高濃度氮源外加紅光輔助其生長，到達平臺期則提供高光強白光，不同階段采用不同生長策略，以期在短時間內(nèi)積累更多生物量。

3.2 不同環(huán)境因子對微擬球藻脂肪酸積累的影響

微擬球藻以富含EPA等多不飽和脂肪酸而備受關(guān)注，其脂肪酸主要以結(jié)構(gòu)脂(磷脂、糖脂)以及儲存脂(甘油三酯)兩種形式存在，可用于制備高品質(zhì)生物柴油[32]。諸多研究表明，不同環(huán)境因子下微擬球藻脂肪酸積累存在明顯差異[33]。因此，解析不同環(huán)境因子對其脂肪酸積累的影響，確定其最優(yōu)積累條件，是高效利用微擬球藻的基礎(chǔ)[34]。

本研究中，培養(yǎng)25 d的微擬球藻，光強從140 μmol photons·m-2·s-1降至20 μmol photons·m-2·s-1時，EPA含量從8.687%增至11.802%，與Pal等[35]的結(jié)果類似，即當(dāng)微擬球藻培養(yǎng)7 d，光強從700 μmol photons·m-2·s-1降低至170 μmol photons·m-2·s-1時，EPA含量從10.8%增加到17.8%。可見，微擬球藻中EPA含量與光強呈反比。據(jù)報道，在光脅迫條件下，微擬球藻UFA含量會隨著光強的增加而減少，而在光飽和條件下，微擬球藻UFA含量則隨著光強的增強而增加，可能由于在強光脅迫下，微擬球藻細胞膜流動性降低，而UFA尤其是EPA的大量合成能抑制強光對其細胞膜流動性的影響[36]。

本研究發(fā)現(xiàn)(表2)，氮、磷對于微擬球藻脂肪酸積累的影響明顯大于光強和光質(zhì)。據(jù)報道，將氮濃度從60 μmol·L-1增至2 200 μmol·L-1時，微擬球藻中EPA含量從總脂肪酸的8.60%增至24.88%[37]。硝酸鹽濃度從1 800 μmol·L-1降至75 μmol·L-1時，微擬球藻EPA含量顯著降低[36]。這與本試驗結(jié)果類似，當(dāng)?shù)獫舛葟?.46 mg·L-1提高至55.40 mg·L-1時，微擬球藻EPA含量從2.887%增至20.502%，UFA含量從53.246%增至68.233%。表明充足的氮源更有利于EPA的合成。氮濃度過低會導(dǎo)致細胞營養(yǎng)不良，生長受限，而氮濃度過高也會導(dǎo)致細胞因大量合成銨離子而產(chǎn)生銨中毒現(xiàn)象[38]。據(jù)報道，在氮缺乏條件下，額外添加碳源可提高脂肪酸合成前體的供給，減少UFA的循環(huán)利用，以增加其在細胞內(nèi)的含量，應(yīng)對氮缺乏所帶來的壓力[39]。Shi等[40]研究發(fā)現(xiàn)，將微擬球藻(N.oceanica)分別培養(yǎng)于正常條件和無磷培養(yǎng)基中，無磷試驗組中脂肪酸迅速積累，其中 C18：1 和 C16：0 最為顯著，多不飽和脂肪酸C20：5和C20：4積累則相對減少。最終結(jié)果顯示，大多數(shù)脂肪酸在磷缺乏條件下的積累速率顯著高于正常培養(yǎng)條件。本試驗得到類似的結(jié)果，當(dāng)磷濃度從2.24 mg·L-1繼續(xù)降低時，C18：1 和 C16：0含量明顯上升，C20：5n-3和C20：4n-6含量顯著下降，表明磷濃度變化對不同脂肪酸的影響不同。

本試驗發(fā)現(xiàn)，在不同光質(zhì)照射下，微擬球藻胞內(nèi)SFA比例為38.787%～48.497%，UFA比例為51.503%～61.213%。G1組EPA占比最大，且隨著紅光比例的降低，EPA積累逐漸增多，隨著藍光比例的下降，EPA積累逐漸降低。有研究證實，紅藍光更有利于微擬球藻生物量的積累，而純綠光則更有利于不飽和脂肪酸尤其是EPA的積累[31]。由此可知，在微擬球藻作為高脂餌料的制備過程中，想要獲得更多的EPA積累，降低紅光同時增加藍綠光比例，也許是一個新思路。

3.3 不同環(huán)境因子對微擬球藻色素積累的影響

葉綠素a廣泛存在于大型陸生植物到小型單細胞微藻中[41]，起著分離電荷和固定光能、實現(xiàn)高效捕光以驅(qū)動光合反應(yīng)的作用[42]。β-胡蘿卜素顏色鮮艷，能夠富集在動物體內(nèi)使之呈現(xiàn)不同顏色，如小丑魚鮮艷的外表以及鮭魚的肉[43]。此外，β-胡蘿卜素在植物應(yīng)對環(huán)境脅迫(如干燥和低溫)中也起著重要的保護作用[44]。

本研究結(jié)果表明，微擬球藻在適宜培養(yǎng)條件下，藻液外觀呈翠綠色，而在環(huán)境脅迫狀態(tài)下，會呈橘黃色甚至黃褐色，表明環(huán)境因子對其色素積累有影響。光強試驗中，微擬球藻顏色隨著光強增加而逐漸由綠變黃，這種變化主要是由β-胡蘿卜素和葉綠素a的比例變化導(dǎo)致的，與高保燕等[45]的研究結(jié)果類似。由于葉綠素a呈現(xiàn)藍綠色，β-胡蘿卜素呈現(xiàn)橙黃色[46]，在弱光20 μmol photons·m-2·s-1下胞內(nèi)葉綠素a比例最高，因此藻液呈現(xiàn)翠綠色，而在強光200 μmol photons·m-2·s-1下葉綠素a比例降低，β-胡蘿卜素比例升高，藻液則變?yōu)辄S褐色，這解釋了微擬球藻在環(huán)境因子脅迫下呈現(xiàn)黃褐色的原因。

據(jù)報道，微擬球藻在250 μmol photons·m-2·s-1光強下，葉綠素a合成受限[47]。微藻在適宜的光強下才能有效地進行光合作用，當(dāng)光強達到甚至超過光飽和點時，光合作用被抑制，活性氧(reactive oxygen species, ROS)上升，光合作用細胞器受損[48]，這可能是導(dǎo)致葉綠素a含量下降的原因。本試驗中，弱光對葉綠素a積累影響較為顯著，而氮、磷則對多種微量類胡蘿卜素積累影響更大，表明光強和營養(yǎng)鹽對于微擬球藻色素積累的影響大于光質(zhì)，其原因可能是微藻色素大分子的生物合成過程對氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的濃度比較敏感[49]。光質(zhì)試驗中，G1組葉綠素a比例最低，這可能表示微擬球藻對綠光吸收效率較低。因此，合理設(shè)置營養(yǎng)鹽組成和光照強度等條件，可以作為調(diào)控微擬球藻目標(biāo)色素產(chǎn)量的有效手段之一。

3.4 不同環(huán)境因子對微擬球藻可溶性糖和蛋白積累的影響

微擬球藻在L4組有最大可溶性糖和蛋白含量，同時該試驗組生物量也最大，推測在該光強下，由于營養(yǎng)充分，光線充足，此時微藻胞內(nèi)碳源分配策略以供應(yīng)細胞分裂和合成蛋白骨架為主。光質(zhì)試驗中，光質(zhì)條件不同，微擬球藻的碳分配策略也不同，R1～R3組，紅光比例逐漸降低，導(dǎo)致蛋白積累量提升，可溶性糖積累量則下降，表明紅光條件下微擬球藻碳分配策略主要以積累可溶性糖為主。與其余所有先質(zhì)組相比，G1組蛋白積累量顯著下降，推測純綠光會抑制微擬球藻積累蛋白質(zhì)。氮濃度和磷濃度試驗中，N4和P4試驗組由于營養(yǎng)缺乏，細胞生長受到明顯抑制，蛋白積累量極低，分別為0.40和0.26 mg·mL-1，且N4試驗組SFA合成含量大幅上升，推測在營養(yǎng)鹽缺乏條件下，部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪酸以幫助細胞應(yīng)對不良環(huán)境。Sun等[50]研究表明，在不良環(huán)境下，蛋白質(zhì)的降解是脂質(zhì)和可溶性糖合成的主要底物來源，氮源缺乏導(dǎo)致微擬球藻應(yīng)激增強，淀粉合成路徑則會轉(zhuǎn)向類胡蘿卜素和脂質(zhì)的合成路徑，因此在氮制約下，細胞內(nèi)部碳分配出現(xiàn)顯著變化。本試驗N4組可溶性糖含量下降也與Sun等[50]的結(jié)果一致，由于脂肪酸能夠幫助細胞抵御外界不良環(huán)境，因此微擬球藻由合成淀粉、蛋白為主的碳分配策略轉(zhuǎn)而以脂質(zhì)合成為主，進而影響微擬球藻的逆境適應(yīng)性。

4 結(jié)論

本試驗探究了4種環(huán)境因子對微擬球藻營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，通過測定其生長及營養(yǎng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)純紅光或氮濃度為55.40 mg·L-1條件下，指數(shù)期生長速率較快，而200 μmol photons·m-2·s-1光強條件下微擬球藻在指數(shù)末期至平臺期生長速率較快。氮、磷對脂肪酸、類胡蘿卜素積累的影響較大。氮濃度為55.40 mg·L-1時UFA有最大積累比例(68.233%)，同時EPA比例也達到最大(20.502%)。弱光20 μmol photons·m-2·s-1組葉綠素a占比達到最大(55.114%)，β-胡蘿卜素在純綠光下有最大比例(48.281%)。高光強200 μmol photons·m-2·s-1組中可溶性糖和蛋白含量最大，表明一定程度的強光會促進可溶性糖和蛋白的積累。