谷玉娟 毛 豐 路芳芳 劉 斌 劉 磊,* 高 慧

(1 河北科技師范學(xué)院，河北 秦皇島 066004；2 淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223300；3 蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215004)

小麥(TriticumaestivumL.) 是世界重要的谷物資源之一，也是我國第三大糧食作物，其產(chǎn)量對我國的糧食安全有著重要影響[1-2]。小麥單位面積產(chǎn)量由穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重共同決定[3]，同時已有研究表明，異源三聚體G蛋白對小麥穗數(shù)等具有重要作用[4]。

異源三聚體G蛋白(heterotrimeric G protein，簡稱G蛋白)是由Gα、Gβ和Gγ 3個亞基組成的蛋白復(fù)合體，廣泛存在于動植物體內(nèi)[5]。人類基因組中有大約700種獨(dú)特的異源三聚體G蛋白[6]和16個編碼Gα、5個編碼Gβ和12個編碼Gγ的基因，導(dǎo)致G蛋白異源三聚體具有結(jié)構(gòu)和功能多樣性[7-8]。與動物相比，植物體中Gα、Gβ和Gγ的數(shù)目明顯減少[9]。大多數(shù)植物編碼1個Gα、1個Gβ和5個Gγ亞基[10-11]。Gγ亞基具有較大的序列多樣性[5]，因此，一般認(rèn)為植物Gγ決定信號的特異性。

基于對水稻中G蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，水稻含有5個G蛋白γ亞基，分別為RGG1、RGG2、GS3、DEP1和GGC2，其中G蛋白γ亞基DEP1在產(chǎn)量和氮肥高效利用等方面均發(fā)揮重要作用[11]。DEP1是從中國超級稻沈農(nóng)265中克隆的直立密穗基因，位于第9條染色體[12]。DEP1編碼植物特有的、非典型的Gγ亞基由426個氨基酸組成，含有1個GGL結(jié)構(gòu)域、1個TNFR/NGFR結(jié)構(gòu)域和多個VWFC結(jié)構(gòu)域[3]。dep1為功能獲得型突變，可以提高水稻分生組織活性，增加水稻穗部一次枝梗數(shù)、二次枝梗數(shù)和穗粒數(shù)，也可以降低株高，使水稻半矮化、耐倒伏、耐密植，從而顯著提高水稻產(chǎn)量[13-14]。此外，DEP1基因的表達(dá)受氮素誘導(dǎo)，dep1可增強(qiáng)水稻對于氮的吸收和同化能力，提高氮肥利用效率，進(jìn)而提高收獲指數(shù)和產(chǎn)量[15]。

小麥基因中含有水稻(OryzasativaL.)DEP1的同源基因，被命名為TaDEP1。TaDEP1位于小麥第5條染色體，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子[16-17]。前人研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas系統(tǒng)獲得的TaDEP1突變體株高明顯降低[18]，而且RNAi干涉小麥TaDEP1基因?qū)е滦←溗肓?shù)減少[19]，表明TaDEP1基因的轉(zhuǎn)錄水平對其功能有重要影響。但截至目前，在TaDEP1基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控方面鮮有深入研究。因此，本研究以小麥缺體-四體系及260份微核心種質(zhì)為試驗(yàn)材料，利用分子生物學(xué)手段解析小麥TaDEP1基因啟動子的序列變異對其轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期為小麥遺傳改良提供基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)調(diào)控元件及基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 本研究所用小麥材料中國春、缺體-四體系[20]及微核心種質(zhì)[21]均由淮陰師范學(xué)院作物遺傳改良教研室保存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。RNA iso Plus(DP437)試劑盒、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)試劑盒和TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(RR820A)試劑盒，均產(chǎn)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1TaDEP1啟動子的克隆 利用CTAB法提取中國春品種小麥的DNA。根據(jù)中國春品種小麥的TaDEP1啟動子序列設(shè)計(jì)引物TaDEP1F1與TaDE1R1，進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物見表1。PCR反應(yīng)總體系為20 μL：2× KOD FX buffer 10 μL，KOD FX酶0.4 μL，2 mmol·L-1dNTPs 4 μL，上游引物和下游引物各0.1 μL，TaDEP1啟動子DNA模板2 μL，ddH2O 3.4 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，57℃退火30 s，68℃延伸30 s，32個循環(huán)。分別設(shè)計(jì)53、56、59、62、65、68℃的退火溫度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，檢測其最適退火溫度。目的片段長度為2 000 bp。

1.2.2 小麥TaDEP1 D組啟動子擴(kuò)增及其特異性鑒定 利用CTAB法提取小麥缺體-四體系(N5AT5D、N5BT5D和N5DT5B)基因組DNA。利用1.2.1的引物及最適退火溫度進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件同1.2.1。

1.2.3TaDEP1基因轉(zhuǎn)錄水平差異性鑒定 根據(jù)啟動子差異序列設(shè)計(jì)引物TaDEP1F2和TaDEP1R2，對小麥260份微核心種質(zhì)材料TaDEP1 D組啟動子進(jìn)行多態(tài)性鑒定。引物序列見表1。

以GADPH為內(nèi)參基因，利用實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測小麥TaDEP1基因的轉(zhuǎn)錄水平。qRT-PCR反應(yīng)總體系為20 μL：2× SYBR 10 μL，上、下游引物各0.1 μL， cDNA模板1 μL，ddH2O 9.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。所用引物TaDEP1F3、TaDEP1R3和GADPHF、GADPHR見表1。

1.2.4 LUC活性試驗(yàn) 利用同時含有螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase，LUC)和螢光素酶(renilla luciferase，RLUC)兩種報(bào)告基因的pGreenⅡ0800-LUC載體作為載體骨架，以KpnI和HindⅢ連入待檢測啟動子的序列。引物序列TaDEP1F4和TaDEP1R4見表1。將上述質(zhì)粒導(dǎo)入小麥原生質(zhì)體中，用Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega，美國)檢測LUC和RLUC活性[22]，并以RLUC水平作為內(nèi)參來校準(zhǔn)LUC水平，進(jìn)而計(jì)算待測啟動子活性。

表1 各引物序列匯總Table 1 Summary of all primers

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaDEP1 D組啟動子的特異擴(kuò)增

以中國春小麥基因組DNA為模板，利用TaDEP1基因啟動子引物進(jìn)行PCR溫度梯度擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1-A所示。當(dāng)退火溫度設(shè)為53℃時，PCR的擴(kuò)增條帶最弱；隨著退火溫度升高，擴(kuò)增的條帶逐漸增強(qiáng)；當(dāng)溫度達(dá)到62～68℃時，擴(kuò)增效果最好。通過對比Marker可知，擴(kuò)增的條帶大小約為2 000 bp，與NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 公布的序列大小基本一致。前期研究報(bào)道，TaDEP1基因分別位于5A、5B和5D染色體[19]。為進(jìn)一步明確條帶的特異性，本研究以小麥缺體-四體系(N5AT5D、N5BT5D和N5DT5B)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如圖1-B所示。小麥缺體-四體系N5AT5D和N5BT5D均能擴(kuò)增出2 000 bp大小的條帶，N5DT5B未擴(kuò)增出條帶，表明該引物TaDEP1F1與TaDEP1R1擴(kuò)增的條帶為5D染色體的TaDEP1基因啟動子序列。

注：A：TaDEP1基因啟動子溫度梯度擴(kuò)增；B：在小麥缺體-四體系中擴(kuò)增TaDEP1 基因啟動子；M：DNA Marker。Note: A: Amplification of the TaDEP1 promoter by gradient temperature PCR. B: Amplification of the TaDEP1 promoter in wheat nulli-tetrasomics. M: DNA Marker.圖1 小麥 TaDEP1 D亞基因組啟動子的特異擴(kuò)增Fig.1 The specific amplification of the wheat TaDEP1 promoter in D subgenome

2.2 小麥TaDEP1 D組啟動子存在遺傳變異

試驗(yàn)以京411基因組DNA為模板，利用引物TaDEP1F1和TaDEP1R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，并與中國春基因組DNA為模板的條帶序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，京411與中國春的啟動子序列主要存在3處序列差異(圖2)。其中，417位表現(xiàn)為缺失1個G，508位表現(xiàn)為G，652～783位表現(xiàn)為缺失132 bp。

2.3 在小麥微核心種質(zhì)中鑒定132 bp的序列差異

根據(jù)上述差異序列，設(shè)計(jì)鑒定引物TaDEP1F2和TaDEP1R2(表1)。其中，中國春擴(kuò)增的產(chǎn)物長度為741 bp，京411擴(kuò)增的產(chǎn)物長度為608 bp(圖3-A)。為進(jìn)一步分析上述序列差異在微核心種質(zhì)中的分布情況，提取小麥微核心種質(zhì)材料的基因組DNA，并利用引物TaDEP1F2和TaDEP1R2特異性擴(kuò)增小麥TaDEP1 D組啟動子序列，并進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3-B所示。在260份微核心種質(zhì)材料中，只有紅花麥、白花麥和中國春的TaDEP1 D組啟動子含有132 bp的差異序列，表明該序列在種質(zhì)材料中分布較少。

圖2 京411與中國春小麥TaDEP1擴(kuò)增序列對比Fig.2 Alignment of the promoter sequences of TaDEP1 in Chinese spring and J411

注：A：中國春與京411小麥TaDEP1PCR擴(kuò)增序列比對；B：15種小麥中TaDEP1 PCR擴(kuò)增結(jié)果。Note: A: Alignment of TaDEP1 PCR amplified sequences in China Spring and J411. B: PCR amplification results of TaDEP1 in 15 kinds of wheat.圖3 在小麥微核心種質(zhì)中鑒定132 bp的序列差異Fig.3 Identification of 132 bp sequence differences in wheat micro-core collections

2.4 132 bp差異序列影響TaDEP1基因的轉(zhuǎn)錄水平

前期研究報(bào)道，小麥VRN-B3B等位基因中的890 bp插入顯著降低了VRN-B3基因的轉(zhuǎn)錄[23]，暗示啟動子區(qū)域的序列變異可能影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。為探究132 bp差異序列變異是否對小麥TaDEP1基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生影響，本試驗(yàn)從微核心種質(zhì)材料中隨機(jī)提取15份小麥的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄，利用qRT-PCR檢測TaDEP1基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如圖4所示，紅花麥、白花麥和中國春小麥(含13種差異序列)中TaDEP1基因的平均相對轉(zhuǎn)錄水平是0.001 34，而缺失132 bp差異序列的其余12種小麥TaDEP1基因相對轉(zhuǎn)錄水平的平均值為0.000 13，約為含132 bp差異序列小麥品種中TaDEP1基因轉(zhuǎn)錄水平的10%。上述結(jié)果表明，132 bp差異序列增強(qiáng)小麥TaDEP1基因的轉(zhuǎn)錄水平。為進(jìn)一步分析該132 bp差異序列中包含的特殊作用元件，利用PlantCARE軟件(http://sphinx.rug.ac.be:8080/PlantCARE/)對該序列進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)特殊順式作用元件，暗示132 bp序列的完整性對轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是必需的。

注：虛線代表相應(yīng)品種中TaDEP1基因轉(zhuǎn)錄水平的平均值。Note: The average of the transcriptional level of TaDEP1 was labeled by the dotted line.圖4 TaDEP1在15個不同品種小麥中的轉(zhuǎn)錄水平鑒定Fig.4 The expression level of TaDEP1 among 15 different wheat varieties

2.5 132 bp差異序列是小麥基因啟動子轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列

為進(jìn)一步探究132 bp對小麥基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用，將中國春TaDEP1基因啟動子以及缺失132 bp的啟動子序列連入pGreenⅡ 0800-LUC載體(圖5-A)， 并瞬時轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體，以空載體作為空白對照，進(jìn)行LUC活性檢測。結(jié)果顯示，空載體對照的LUC活性幾乎檢測不到，含中國春TaDEP1基因啟動子驅(qū)動的LUC平均活性為23，缺失132 bp的啟動子序列驅(qū)動的LUC活性為7，顯著低于全長啟動子驅(qū)動的LUC活性(圖5-B)，表明小麥TaDEP1基因啟動子132 bp序列促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，是TaDEP1基因啟動子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列。

3 討論

水稻OsDEP1在增產(chǎn)和提高氮利用效率中表現(xiàn)出多效作用[24]，小麥TaDEP1與穗長及其產(chǎn)量也存在正調(diào)控關(guān)系[25]。進(jìn)一步研究表明，OsDEP1啟動子區(qū)域序列變異影響穗部性狀[26]。因此，研究TaDEP1基因的啟動子序列變異及其影響具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的順式作用元件結(jié)合啟動基因的轉(zhuǎn)錄，啟動子是決定基因時空表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)鍵因素。本研究利用小麥缺體-四體系為試驗(yàn)材料，特異擴(kuò)增出中國春小麥D基因組染色體中的TaDEP1啟動子序列(圖1)。然而，利用京411擴(kuò)增得到的啟動子序列缺失132 bp(圖2)。為進(jìn)一步分析該序列差異在小麥中的分布情況，本研究利用260份微核心種質(zhì)材料對TaDEP1啟動子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示只有紅花麥、白花麥和中國春3個品種的小麥TaDEP1啟動子存在132 bp的序列(圖3)，表明該啟動子序列是一種稀有單倍型。另外，TaDEP1啟動子的132 bp僅存在于極少數(shù)農(nóng)家品種中，不存在于主栽品種中，而主栽品種的穗部性狀普遍優(yōu)于農(nóng)家種，可能存在兩方面原因：一方面該單倍型的稀有性導(dǎo)致并未被現(xiàn)代育種所應(yīng)用，而主栽品種的穗部性狀是由于其他穗形優(yōu)異基因聚合形成；另一方面是TaDEP1正向調(diào)控株高[18]，表現(xiàn)出一因多效性，基于綜合性狀表現(xiàn)，該單倍型未被應(yīng)用。

注：A：TaDEP1基因不同啟動子形式連入pGreenⅡ 0800-LUC 載體的構(gòu)建示意圖；B：TaDEP1基因不同啟動子形式啟動LUC的轉(zhuǎn)錄。***表示在P<0.001水平差異顯著。Note: A: Schematic diagram of pGreenⅡ 0800-LUC vector construction with different TaDEP1 pomoter sequence. B: Different TaDEP1 pomoter sequence activate LUC. *** indicate significant difference at 0.001 level.圖5 132 bp差異序列增強(qiáng)LUC活性Fig.5 The retention of 132 bp enhances LUC activity

前期研究發(fā)現(xiàn)，TaGW2啟動子區(qū)域單個核苷酸變化影響TaGW2的轉(zhuǎn)錄水平，繼而影響小麥籽粒寬度[27]；隨后，Zheng等[28]發(fā)現(xiàn)普通小麥A基因組TaTEF轉(zhuǎn)錄水平受其啟動子突變影響；此外，Wang等[29]證明中國春B基因組TaBT1啟動子發(fā)生突變后影響其基因的轉(zhuǎn)錄水平。上述研究表明，小麥基因啟動子突變與其基因的轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)。為探究132 bp長的差異序列對TaDEP1基因轉(zhuǎn)錄的影響，本研究利用微核心種質(zhì)材料進(jìn)行了qRT-PCR檢測。結(jié)果顯示，紅花麥、白花麥和中國春3個品種中TaDEP1轉(zhuǎn)錄水平明顯高于其他品種，平均水平約是其他品種的10倍(圖4)。為進(jìn)一步說明132 bp序列對小麥基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，本研究利用LUC活性試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，132 bp差異序列的存在可顯著提高TaDEP1基因的轉(zhuǎn)錄水平(圖5)，說明132 bp差異序列是TaDEP1基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)順式作用元件。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件的發(fā)現(xiàn)為研究TaDEP1基因在小麥中的調(diào)控機(jī)制提供了新思路。

4 結(jié)論

本研究鑒定到小麥TaDEP1基因D組啟動子序列存在132 bp的序列變異，并且該132 bp序列差異直接影響TaDEP1基因的轉(zhuǎn)錄水平。進(jìn)一步研究表明，上述132 bp差異序列為小麥基因啟動子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列。本研究結(jié)果證明了啟動子的變異影響基因轉(zhuǎn)錄水平，豐富了小麥TaDEP1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的理論體系，并為小麥分子研究及其遺傳改良提供了新的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件以及基因資源。