譚瑗瑗 汪 慶 富昊偉 張渭章 吳三玲 舒慶堯,*

(1 浙江大學(xué)作物科學(xué)研究所/國家水稻生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058；2 無錫哈勃生物種業(yè)技術(shù)研究院有限公司, 江蘇 無錫 214100；3 嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314024；4 浙江之豇種業(yè)有限責(zé)任公司, 浙江 杭州 311107；5 浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測試平臺，浙江 杭州 310058)

雜交水稻的大面積應(yīng)用極大地推動(dòng)了我國及印度、越南、緬甸、印度尼西亞等亞洲國家的水稻生產(chǎn)[1]。近十多年來，涌現(xiàn)了一批以粳稻不育系與秈稻廣親和恢復(fù)系配制的粳秈亞種間雜交稻，如寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國水稻研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等單位先后育成了春江16A[2]、浙粳7A[3]、甬粳15A[4]等系列粳型不育系，配制出春優(yōu)84[5]、浙粳優(yōu)6153[3]、甬優(yōu)1540[4]等一批強(qiáng)優(yōu)勢品種并在生產(chǎn)上應(yīng)用。李錚友于在1973年實(shí)現(xiàn)了粳型雜交稻三系配套，開創(chuàng)了我國雜交粳稻的研究，并選育出“滇型”系列不育系[6]。國內(nèi)科研單位也于上世紀(jì)80年代開始了兩系雜交粳稻育種和兩系粳型不育系的研究[7]。

與三系法相比，兩系法雜交水稻具有配組自由、育種程序簡單、育種周期短、能克服三系不育細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[8]。兩系法水稻研究始于石明松在1973年發(fā)現(xiàn)的光敏不育水稻農(nóng)墾58S[9]，之后國內(nèi)開始大規(guī)模鑒定和培育光溫敏不育水稻材料，育成了如衍生自農(nóng)墾58S的培矮64S[10]、株1S[11]和安農(nóng)S-1[12]等兩系不育系。上世紀(jì)90年代中期，我國實(shí)現(xiàn)了基于兩系雜交水稻的生產(chǎn)應(yīng)用[13]。目前審定的兩系水稻品種主要來自Y58S、培矮64S、株1S等秈型不育系[14]。

在培育出第一個(gè)粳型兩系不育系農(nóng)墾58S后，遼寧省水稻研究所等陸續(xù)育成了108S、7001S、C407S、L62S等粳型不育系[7]。與秈稻兩系不育系相比，粳型兩系不育系數(shù)量較少，多數(shù)未能在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用，且存在遺傳基礎(chǔ)較狹窄、優(yōu)質(zhì)不育系少、制種產(chǎn)量低等問題[15]。因此，選育新的優(yōu)良粳稻不育系已成為推動(dòng)水稻雜種優(yōu)勢利用和雜交粳稻品種培育的當(dāng)務(wù)之急。

為促進(jìn)兩系法雜交稻的培育和利用，本研究綜合運(yùn)用花藥培養(yǎng)和誘發(fā)突變技術(shù)育成一個(gè)早熟、優(yōu)質(zhì)、抗性好的兩系粳稻不育系江79S，以江79S為母本，與廣親和恢復(fù)系江恢1501雜交，育成一個(gè)雜交水稻新品種江兩優(yōu)7901，以期本研究為綜合運(yùn)用花培和輻照誘變技術(shù)培育新兩系不育系材料提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 選育方法

江79S來自雜交組合培矮64S/粳稻H179，由浙江大學(xué)作物科學(xué)研究所先進(jìn)育種實(shí)驗(yàn)室通過花培與誘變育成，表1為其培育流程。水稻花藥培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[16]。誘變處理經(jīng)中科院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(Heavy Ion Research Facility Lanzhou, HIRFL)完成，S79干種子用300 MeV·u-1的12C6+離子束輻射處理，劑量率為0.5 Gy·min-1，輻射劑量為80 Gy。

1.2 育性轉(zhuǎn)換特性鑒定

1.2.1 田間育性轉(zhuǎn)換鑒定 2018年在浙江嘉興(120°43′E、30°50′N)進(jìn)行，從5月15日開始每隔10 d播種，至7月5日結(jié)束，單本移栽，開花期田間觀察花粉育性并鏡檢，確定育性轉(zhuǎn)換特性。

1.2.2 人工氣候室育性鑒定 根據(jù)《NY/T 1215-2006水稻光、溫敏核不育系育性鑒定規(guī)程》[17]，在中國水稻所人工氣候箱設(shè)置不同光溫條件(表2)，對江79S進(jìn)行育性測試，觀察花粉育性和自交套袋結(jié)實(shí)率。

1.3 稻瘟病抗性與稻米品質(zhì)測定

1.3.1 稻瘟病抗性鑒定 由浙江省種子管理總站統(tǒng)一委托浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所鑒定江79S苗期稻瘟病抗性。2018年檢測單位對供試材料浸種、催芽，每份材料穴播10～15粒，水稻秧苗3～4葉期時(shí)接種。將接種后的秧苗置于25～28℃的恒溫室內(nèi)，遮光保濕24 h。去除遮光條件后，定時(shí)噴霧保濕。試驗(yàn)設(shè)2次重復(fù)。苗葉瘟在感病對照達(dá)7級或以上時(shí)進(jìn)行調(diào)查，每個(gè)品種取發(fā)病最重的3片葉的結(jié)果作為抗性評價(jià)的依據(jù)，苗葉瘟調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)參照《NY/T 2646-2014 水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評價(jià)技術(shù)規(guī)程》[18]。

1.3.2 稻米品質(zhì)測定 2018年春在海南收獲成熟江79S種子，曬干后取500 g用于稻米品質(zhì)檢測，檢測單位為中國水稻研究所-農(nóng)業(yè)部(現(xiàn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部)稻米及制品抽量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心。依據(jù)《NY/T 83-2017米質(zhì)測定方法》[19]檢測糙米率、堊白度、透明度、堿消值、精米率、堊白粒率、國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 21719-2008稻米整精米率檢驗(yàn)法》[20]檢測膠稠度、直鏈淀粉、整精米率，并依據(jù)《NY/T 593-2013食用稻品種品質(zhì)》[21]標(biāo)準(zhǔn)確定樣品品質(zhì)等級。

1.4 全基因組測序和性狀等位基因鑒定

隨機(jī)選取10株生長30 d左右的江79S植株葉片，等量混合10個(gè)單株葉片提取DNA，利用NovaSeq6000高通量測序儀對樣品進(jìn)行測序(Illumina，北京百邁克生物科技有限公司)，測序深度為30×。測序完成后按以下步驟對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：(1)利用NGSQCtookit v2.3.3軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控；(2)利用BWA v0.7.17軟件將質(zhì)控后質(zhì)量合格的讀序映射到水稻參考基因組IRGSPv1.0(https://plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index);(3)通過Samtools v1.2將映射后得到的SAM文件轉(zhuǎn)成BAM文件并刪除潛在的PCR重復(fù)序列；(4)為保證變異的準(zhǔn)確性，利用picard-tools v1.108軟件再次刪除重復(fù)序列；(5)最后用GATK v4.2工具包進(jìn)行變異檢測。根據(jù)上海師范大學(xué)黃學(xué)輝團(tuán)隊(duì)[22]對水稻重要性狀基因等位信息的整理結(jié)果(http://www.xhhuanglab.cn/tool/RiceNavi.html)，通過檢測江79S序列變異情況判斷其是否含有光溫敏不育和稻瘟病抗性的等位基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 選育過程

2012年春，種植培矮64S/粳稻H179的F1植株，抽穗期取花藥進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得約150株再生苗。再生苗中約有60株為單倍體，表現(xiàn)為植株矮小、不結(jié)實(shí)。再生苗中正常生長的植株在9月5日前抽穗，其中11株表現(xiàn)不育但長勢較好，割茬再生并在海南收獲種子，于2013年同時(shí)在浙江嘉興和江蘇無錫分期播種，觀察其育性和農(nóng)藝性狀。11個(gè)DH不育系中S79株系綜合表現(xiàn)優(yōu)異，但生育期長，屬于典型晚粳類型，表現(xiàn)雄性完全不育的時(shí)間較短。

為培育生育期較短的光溫敏不育系，2013年冬采用高能碳離子束處理S79種子，在海南種植獲得M2種子。2014年，于5月上旬在浙江嘉興直播M2種子，8月中旬在約68 000株M2中篩選到9個(gè)早抽穗單株。同年在海南陵水，將9個(gè)早穗植株割茬再生獲得的種子與S79一起按株系種植，觀察發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)株系較S79遲抽穗5 d，綜合農(nóng)藝性狀好，將該突變系定名為GS79。

表1 粳型光溫敏不育系江79S的選育流程Table 1 The breeding flow of the Japonica photoperiod/temperature sensitive male seterile (PTGM) line Jiang 79S

將突變系GS79和其親本S79于2015年5月15日在嘉興同期播種，前者的抽穗時(shí)間較后者早約7 d(圖1)。之后經(jīng)多次種植比較，嘉興5月播種時(shí)GS79抽穗較S79早，即播種越早差異越大；海南12月播種時(shí)GS79抽穗較S79遲5 d左右。

2.2 育性轉(zhuǎn)換特性

在海南陵水12月中下旬播種，江79S在3月上中旬始穗，表現(xiàn)完全可育，結(jié)實(shí)率達(dá)到80%以上，和常規(guī)粳稻接近。即使推遲至1月中旬播種，4月上旬抽穗，育性仍表現(xiàn)正常。上述結(jié)果表明該不育系在短日條件下的可繁性好。

圖1 水稻花培系S79與其熟期突變體GS79田間表現(xiàn)Fig.1 The performance of S79 derived from anther culture and its heading date mutant GS79 in field

在浙江嘉興，從5月上中旬開始進(jìn)行6期的分期播種，8月25日開始隔日鏡檢，直至9月8日出現(xiàn)極少量黑染花粉，9月15日有大量花粉染成黑色，表明已經(jīng)轉(zhuǎn)為可育。套袋自交結(jié)實(shí)考查結(jié)果表明，前期結(jié)實(shí)率均為0，9月8日自交結(jié)實(shí)率為0.1%，9月15日自交結(jié)實(shí)率為19.7%，與鏡檢結(jié)果一致。

2015年在人工氣候箱中對江79S不同光溫條件對育性的影響進(jìn)行了測試。結(jié)果表明，在14.5 h長日照條件下，3個(gè)溫度(28、24、23℃)處理后，花粉育性和自交結(jié)實(shí)率均為0，表現(xiàn)完全不育。隨著日照時(shí)間縮短，經(jīng)24或23℃處理后，育性有所回復(fù)，但平均結(jié)實(shí)率均維持在較低水平(表2)，這與短日照自然條件下的正常結(jié)實(shí)表現(xiàn)存在較大的差異。

2.3 農(nóng)藝性狀與開花習(xí)性

江79S株型適中，分蘗力較強(qiáng)，葉色深綠，葉片較短，植株較矮，抗倒性好。在浙江嘉興作單季稻種植表現(xiàn)為不育，株高83 cm，單株有效穗數(shù)8.2個(gè)，平均每穗總粒數(shù)可達(dá)到125.9粒，包頸率1.2%，柱頭白色，柱頭基本不外露。在陵水春季(3月初抽穗)種植表現(xiàn)為可育，株高72 cm，單株有效穗數(shù)7.1個(gè)，平均每穗總粒數(shù)達(dá)到97.6粒，結(jié)實(shí)率為81.9%，不包頸，千粒重25.3 g。

江79S為典型粳稻，開花較集中，花期較短。一般秋季晴天11：00左右開花，與粳稻品種相似，但比多數(shù)秈稻品種開花時(shí)間遲0.5 h以上。

2.4 稻米品質(zhì)與稻瘟病抗性

經(jīng)中國水稻研究所-農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心檢測，春季在海南陵水收獲的江79S的稻米品質(zhì)指標(biāo)如下：糙米率83.5%，整精米率70.4%，堊白米率14%，堊白度2.1，堿消值6.7，膠稠度80 mm，透明度1級，直鏈淀粉含量15.8%。綜合評價(jià)達(dá)到三級優(yōu)質(zhì)米標(biāo)準(zhǔn)。

對江79S開展的苗葉瘟抗性鑒定結(jié)果表明，江79S葉瘟平均級1.8級，最高級2級，抗性評價(jià)為“抗”。

表2 江79S光溫敏不育系人工氣候箱鑒定結(jié)果Table 2 Photoperiod/temperature-sensitivity of Jiang 79S tested in phytotron

2.5 配組應(yīng)用

以江79S為母本，與廣親和秈稻恢復(fù)系江恢1501配制雜交水稻品種江兩優(yōu)7901(圖2)，該品種于2016年開始參加長江中下游單季晚粳區(qū)域試驗(yàn)，兩年平均畝產(chǎn)分別達(dá)11.4 t·hm2和10.07 t·hm2，比對照嘉優(yōu)5號分別增產(chǎn)18.2%和15.1%；生產(chǎn)試驗(yàn)畝產(chǎn)平均9.9 t·hm2， 比對照增產(chǎn)9.1%。江兩優(yōu)7901全生育期160.9 d，比對照嘉優(yōu)5號晚熟0.1 d，株高117.7 cm，穗長21.1 cm，有效穗數(shù)217.5萬個(gè)·hm-2，每穗總粒數(shù)260.4粒，結(jié)實(shí)率80.1%，千粒重24.1 g。稻瘟病抗性綜合指數(shù)兩年分別為3.5、4.3，穗頸瘟損失率最高級3.0，中抗稻瘟病。江兩優(yōu)7901已于2018年通過國家主要農(nóng)作物品種審定(國審稻20180119)。

圖2 江兩優(yōu)7901在浙江新昌田間表現(xiàn)Fig.2 The performance of Jiangliangyou 7901 in Xinchang, Zhejiang

2.6 光溫敏不育和抗稻瘟病基因分析

根據(jù)已有的重要基因的克隆和功能研究結(jié)果，利用全基因組測序結(jié)果，分析了江79S中控制光溫敏不育和稻瘟病抗性基因情況?；蛐蛄凶兓瘯绊懕硇停扇鏿ms3基因C→G的突變(基因組第22 054 886 bp的位置)導(dǎo)致水稻從可育變?yōu)椴挥?。?個(gè)光溫敏不育基因分析發(fā)現(xiàn)，江79S不含溫敏不育基因tms5，但含有光敏不育基因pms1和pms3，與農(nóng)墾58S和培矮64S一致(表3)。同樣，Pi21存在不同等位基因類型，基因組第19 835 834～第19 835 848 bp或第19 836 044～第19 835 865 bp位置序列發(fā)生缺失會導(dǎo)致稻瘟病抗性增加。對16個(gè)抗稻瘟病基因進(jìn)行分析，鑒定到江79S含有其中4個(gè)抗性基因，即pi21、Pid3、Pia/RGA4和Pi-ta(表3)。

3 討論

不育系是雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，培育優(yōu)良的粳稻不育系對推動(dòng)雜交粳稻和亞種間雜交稻的選育尤為重要。與秈稻不育系育種相比，粳稻不育系的數(shù)量較少，其中具有產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等方面優(yōu)勢的不育系更為短缺。本研究采用花培與誘變相關(guān)結(jié)合培育了一個(gè)具有良好配合力的粳稻不育系江79S，有望對雜交粳稻育種和秈粳亞種間優(yōu)勢利用發(fā)揮重要作用。在本研究中，采用花藥培養(yǎng)技術(shù)快速培育不育系，并通過誘變技術(shù)對重要性狀進(jìn)行改良，為花培和輻照誘變育種的綜合運(yùn)用提供了范例。

秈粳雜種優(yōu)勢利用以“秈不粳恢”或“粳不秈恢”的育種模式為主。秈型兩系不育系育性穩(wěn)定，“秈不粳恢”模式的花時(shí)差異更加有利于制種。雖然兩系秈型不育系在生產(chǎn)上開展了大面積的應(yīng)用，但兩系法秈粳亞種存在著粒型表現(xiàn)為中間型、株型偏高的問題[23]?！熬欢i恢”模式粳稻花時(shí)遲于秈稻，制種產(chǎn)量低，但可以通過選育早花時(shí)、高外露與柱頭活力強(qiáng)的粳型不育系解決[24]。此外，粳稻兩系不育由核基因控制，相比秈稻更容易通過花藥培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、誘變等技術(shù)對其進(jìn)行改良[25-26]。因此，粳稻兩系不育系具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值且容易創(chuàng)制，不僅能為雜種優(yōu)勢利用提供關(guān)鍵遺傳材料，也能為培育強(qiáng)優(yōu)勢雜交粳稻品種提供重要親本材料。

表3 江79S中光溫敏不育和抗稻瘟病基因序列分析Table 3 The sequence analysis of PTGM genes and rice blast resistant genes in Jiang 79S

育種家通常將光敏不育系與常規(guī)材料雜交，選育獲得新的不育系，但是許多不育系攜帶的不再是原始親本的光敏不育基因。培矮64S含有光敏不育基因，但國內(nèi)的培矮64S為親本選育的多數(shù)新的不育系攜帶溫敏不育基因tms5，如廣占63S及其衍生系，其原因尚不明確[27]。江79S系由培矮64S與H179經(jīng)花培和誘變培育而成，本研究證明其攜帶與培矮64S一樣的光敏不育基因，說明花培和誘變過程未產(chǎn)生新的不育基因。

本研究中，江79S在苗期表現(xiàn)為抗稻瘟病，而全基因組測序結(jié)果表明江79S含有pi21、pid3、pia/RG4和Pi-ta基因，表明江79S的稻瘟病抗性表型與基因型一致。雖然在本試驗(yàn)中未開展江79S穗頸瘟抗性的分析，但已有報(bào)道表明pi21[28]、Pid3[29]和Pi-ta[30]同樣具有穗瘟抗性，因此推測該不育系同樣有較強(qiáng)的穗瘟抗性。綜上可知，不育系江79S適合與其他材料配制組合，培育出抗稻瘟病的雜交稻新品種。

花藥培養(yǎng)和輻照誘變技術(shù)結(jié)合常規(guī)的雜交育種方法同樣適用于水稻新品種培育[31]，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，基因編輯等先進(jìn)技術(shù)方法也用于作物育種中，尤其是用于創(chuàng)制新材料[32-33]。在光敏不育系材料創(chuàng)制方面，林艷等[34]利用TALEN技術(shù)編輯日本晴和明輝86光敏核不育基因PMS3，但突變體不能產(chǎn)生光溫敏不育表型，由此推測與轉(zhuǎn)化品種背景和pms3位點(diǎn)復(fù)雜調(diào)控機(jī)制有關(guān)。農(nóng)春曉[35]利用CRISPR-Cas9技術(shù)獲得pms3+orf4-j突變體，初步判斷T1突變植株的育性受溫度影響，但未有光照時(shí)長對突變育性影響的研究。

作為兩系不育系，江79S配組自由，特別是與廣親和秈稻恢復(fù)系配組，優(yōu)勢強(qiáng)，熟期適中，抗性好，具有重要應(yīng)用前景。如以其為母本配制的江兩優(yōu)7901(江79S/江恢1501)是一典型的亞種間雜交水稻品種，比甬優(yōu)12早熟10 d，且產(chǎn)量相仿，具有超高產(chǎn)的潛力。江79S的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)在柱頭不外露，與秈型恢復(fù)系配制的組合因父母本花時(shí)相差較大，制種產(chǎn)量偏低，需要通過農(nóng)藝手段調(diào)節(jié)或選擇適宜的地點(diǎn)，縮小父母本的花時(shí)差，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)制種。

4 結(jié)論

本研究利用花培和輻照誘變技術(shù)培育了一個(gè)早熟、優(yōu)質(zhì)、抗稻瘟病的光溫敏兩系不育系江79S，并以其為親本，育成國審雜交水稻品種江兩優(yōu)7901。通過對江79S進(jìn)行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其含有來源于農(nóng)墾58S的2個(gè)光敏不育基因pms1和pms3以及4個(gè)抗稻瘟病基因，與本試驗(yàn)中觀察到的光敏不育特性和抗稻瘟表型一致。