劉瑩瑩，張景媛，譚影影，王郝嘉，伍 超，范嘯天，李佳霖，陳美琳，吳嘉瑞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京102488)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)指無過量飲酒史而肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞變性和肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積(主要為三酰甘油)為特征的臨床病理綜合征[1-2]。中醫(yī)認(rèn)為，NAFLD的病機(jī)主要為肝失疏泄，脾失健運(yùn)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，痰濁內(nèi)結(jié)，瘀血阻滯，最終形成痰瘀互結(jié)，痹阻于肝臟脈絡(luò)[3-4]?；瘻岣晤w粒由茵陳、決明子、大黃、澤瀉、豬苓、山楂、蒼術(shù)、白術(shù)、陳皮、瓜蔞、女貞子、墨旱蓮、枸杞子、小薊、柴胡和甘草組成，具有清熱利濕、化濁解毒、祛瘀柔肝而不傷血的作用，臨床上常用于治療濕熱蘊(yùn)結(jié)型脂肪肝[5]。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化滯柔肝顆?？梢越档头蔷凭灾拘愿窝啄Ｐ褪蟊彼徂D(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、三酰甘油和總膽固醇水平[6]。臨床研究結(jié)果表明，化滯柔肝顆粒具有降脂保肝的作用，能顯著改善NAFLD患者的肝功能、血脂等指標(biāo)[5,7-8]。但目前該藥的機(jī)制尚不清楚，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法[9-11]，分析和預(yù)測化滯柔肝顆粒治療NAFLD的作用機(jī)制，以期為揭示化滯柔肝顆粒治療NAFLD作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 資料與方法

1.1 化滯柔肝顆?；衔镄畔⒌乃鸭?/h3>

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)[12]和中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(ETCM)[13]檢索化滯柔肝顆粒中16味中藥的化學(xué)成分，并以藥物口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，篩選得到各味藥的活性成分。

1.2 化滯柔肝顆粒有效成分靶點(diǎn)的收集

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction平臺獲得各中藥主要活性成分的作用靶點(diǎn)[14]。通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲得化合物的SMILES結(jié)構(gòu)式[15]；將活性成分對應(yīng)的SMILES化學(xué)式上傳至Swiss Target Prediction平臺，選擇物種為“Homo sapiens”，預(yù)測出各活性成分的潛在靶點(diǎn)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫查找其靶點(diǎn)對應(yīng)的基因信息，選擇物種為“Homo sapiens”。整合上述信息，獲得化滯柔肝顆?；钚猿煞峙c相關(guān)靶點(diǎn)信息。

1.3 NAFLD疾病靶點(diǎn)收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫、DigSee數(shù)據(jù)庫和美國國家生物信息中心搜索與NAFLD相關(guān)的靶點(diǎn)。其中NAFLD的關(guān)鍵詞為“Nonalcoholic fatty liver disease”“Non-alcoholic fatty liver disease”“Non alcoholic fatty liver disease”和“NAFLD”，整合在不同數(shù)據(jù)庫收集到的靶點(diǎn)，除去重復(fù)靶點(diǎn)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

軟件Cytoscape 3.7.2[16]用于構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，String 11.0數(shù)據(jù)庫[17]用來獲得對應(yīng)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)數(shù)據(jù)集，選取分值>0.7分的置信度數(shù)據(jù)。使用Cytoscape中MCODE插件篩選排序居前2位的關(guān)鍵模塊，以cytohubba插件篩選熱點(diǎn)基因(hub gene)[18]，綜合模塊分析和hub基因相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 對基因進(jìn)行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

運(yùn)用R 4.0.3對化滯柔肝顆粒治療NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路構(gòu)建分析[19-20]。

1.6 分子對接驗(yàn)證

將分析得到的潛在有效成分和潛在靶點(diǎn)進(jìn)行對接。從PubChem下載活性成分的分子結(jié)構(gòu)，通過蛋白質(zhì)PDB數(shù)據(jù)庫下載靶點(diǎn)的pbd文件[21]。利用Autodock Tools 1.5.6對蛋白質(zhì)和小分子化合物進(jìn)行刪水、加氫和設(shè)置原子類型等預(yù)處理后，使用Autodock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對接計(jì)算，利用Pymol 2.3.2軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化處理[22-23]。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合，結(jié)合能越低，其構(gòu)象越穩(wěn)定，一般以結(jié)合能≤-20 929.3 J/mol表示具有較好結(jié)合性。

2 結(jié)果

2.1 化滯柔肝顆?！爸兴?化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

通過篩選，并除去藥材間重復(fù)的化合物，得到有效化合物249個。對上述化合物進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，校正和刪除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到1 186個靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名?；瘻岣晤w?！爸兴?化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見圖1。不同的靶點(diǎn)可對應(yīng)相同的活性成分，同一靶點(diǎn)也可對應(yīng)不同的活性成分，體現(xiàn)了化滯柔肝顆粒治療NAFLD多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜作用特點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)中度值排序居前20的節(jié)點(diǎn)包括14個化合物和6個藥物靶點(diǎn)，表1列出了14個關(guān)鍵化合物的基本信息。

表1 化滯柔肝顆粒“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排序居前20位節(jié)點(diǎn)中的化合物信息Tab 1 Compounds in the top 20 nodes ranked by the degree value in the network of “Traditional Chinese medicine-Compound-Targets” of Huazhi Rougan granules

倒三角形節(jié)點(diǎn)代表藥物靶點(diǎn)，正方形節(jié)點(diǎn)代表化合物分子，六邊形節(jié)點(diǎn)代表中藥；節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度值成正相關(guān)inverted triangle nodes represent drug targets, square nodes represent compound molecules, and hexagonal nodes represent traditional Chinese medicine; the size of the nodes is positively correlated with the degree value of the nodes圖1 化滯柔肝顆?！爸兴?化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Network diagram of “traditional chinese medicine-compound-targets” of Huazhi Rougan granules

2.2 NAFLD相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)

在數(shù)據(jù)庫中共檢索到1 084個與NAFLD相關(guān)的靶點(diǎn)，將其上傳至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫獲得PPI數(shù)據(jù)后，導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建NAFLD相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2a)。模塊分析顯示模塊一(圖2b)得分為31，模塊二(圖2c)得分為19.151，cytohubba分析得到20個與疾病相關(guān)的hub基因(圖2d，顏色越深代表節(jié)點(diǎn)越重要)。最后得到20個與NAFLD相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)均與hub基因重合(圖2d)。

a.NAFLD疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)；b.模塊一；c.模塊二；d.hub基因；節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度值呈正相關(guān)a.PPI network of disease targets of NAFLD; b.module 1; c.module 2; d.hub gene; the size of the nodes is positively correlated with the degree value of the nodes圖2 疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Network diagram of disease targets

2.3 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將“2.1”與“2.2”項(xiàng)下得到的網(wǎng)絡(luò)合并，獲得化滯柔肝顆粒治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建化滯柔肝顆粒治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3a，該網(wǎng)絡(luò)有260個節(jié)點(diǎn)，2 332條邊，節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)度值成正相關(guān))。模塊分析顯示模塊一(圖3b)得分為17.517，模塊二(圖3c)得分為9.667，cytohubba分析得到10個與疾病相關(guān)的hub基因(圖3 d，顏色越深代表節(jié)點(diǎn)越重要)，最終篩選出10個治療的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)，即信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、JUN、白細(xì)胞介素(IL)6、腫瘤壞死因子(TNF)、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、表皮生長因子(EGF)、IL-1β、趨化因子配體2(CCL2)和腫瘤蛋白p53(TP53)。

a.交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)；b.模塊一；c.模塊二；d.hub基因；節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度值呈正相關(guān)a.PPI network of intersection targets; b.module 1; c.module 2; d.hub gene; the size of the nodes is positively correlated with the degree value of the nodes圖3 交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Network diagram of intersection targets

2.4 GO與KEGG富集分析

對10個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，X軸代表所占百分比，Y軸代表?xiàng)l目名稱或通路名稱，氣泡面積代表富集量，顏色由深至淺表示P值由大至小，見圖4。GO富集分析中，確定了25個GO條目。其中，與生物過程(BP)相關(guān)的條目有10個，涉及肽-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)、肽-酪氨酸磷酸化的調(diào)節(jié)、對脂多糖和對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)等方面；與細(xì)胞組分(CC)相關(guān)的條目有5個，涉及RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、血小板α顆粒腔、核染色質(zhì)、血小板α顆粒、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體和細(xì)胞因子受體結(jié)合；與分子功能(MF)相關(guān)的條目有10個，涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活動、受體配體活動、信號受體活化劑活性和生長因子受體結(jié)合等方面。由KEGG富集分析結(jié)果可知，化滯柔肝顆粒治療NAFLD涉及的通路有30條，其中涉及人類疾病-傳染病通路15個，涉及有機(jī)體系統(tǒng)-免疫系統(tǒng)通路4個，涉及人類疾病-癌癥、人類疾病-免疫疾病、人類疾病-內(nèi)分泌和代謝疾病以及環(huán)境信息處理-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各2個，涉及人類疾病-心血管疾病、人類疾病-耐藥性以及環(huán)境信息處理-信號分子和相互作用各1個。推測化滯柔肝顆粒的有效成分可能通過作用于上述通路來達(dá)到治療NAFLD的目的。

A.GO功能富集分析；B.KEGG通路富集分析A.GO functional enrichment analysis; B.KEGG pathway enrichment analysis圖4 富集分析Fig 4 Enrichment analysis

2.5 化滯柔肝顆?！爸兴?關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-GO條目”網(wǎng)絡(luò)

綜合上述分析得到的16個中藥、14個關(guān)鍵成分、10個關(guān)鍵靶點(diǎn)、30條通路及25個GO條目，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-關(guān)鍵成分-潛在靶點(diǎn)-通路-GO條目”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖5。由圖可發(fā)現(xiàn)化合物、靶點(diǎn)、通路間存在錯綜復(fù)雜的關(guān)系，符合中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。篩選度值≥6的化合物4個[槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)、木犀草素(luteolin)和山柰酚(kaempferol)]，靶點(diǎn)10個(IL-6、TNF、IL-1β、CXCL8、JUN、CCL2、STAT3、VEGFA、TP53和EGF)，GO條目13條(4條MF，9條BP)，篩選度值≥1.5倍中位數(shù)的通路2條[晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號通路、人巨細(xì)胞病毒感染信號通路]，推測其為化滯柔肝顆粒治療NAFLD的重要成分、靶點(diǎn)和通路。

通過KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)和Pathway Builder Tool 2.0展示了2條關(guān)鍵通路及相關(guān)潛在靶點(diǎn)的通路-效應(yīng)卡通機(jī)制圖，見圖6。由圖可見，在AGE-RAGE信號通路中，JUN靶點(diǎn)和核因子κB(NF-κB)可以促進(jìn)IL-1β、VEGFA、TNF、CCL2、IL-8和IL-6的表達(dá)；在Human通路中，STAT3可以促進(jìn)VEGFA的表達(dá)，NFAT可以促進(jìn)IL-8的表達(dá)，NF-κB可以促進(jìn)CCL2、IL-8和IL-6的表達(dá)，TP53與細(xì)胞循環(huán)密切相關(guān)。

圖6 通路-效應(yīng)卡通機(jī)制圖Fig 6 Pathway-effect cartoon mechanism diagram

2.6 分子對接驗(yàn)證

選取多元素網(wǎng)絡(luò)中的4個核心化合物與10個核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，最后共得到22個對接結(jié)果，結(jié)果顯示核心化合物與核心靶點(diǎn)結(jié)合活性均較好，見表2。

表2 分子對接結(jié)果Tab 2 Results of molecular docking

3 討論

本研究篩選得到的核心化合物有槲皮素、山柰酚、木犀草素和漢黃芩素。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槲皮素、山柰酚、木犀草素和漢黃芩素都具有抗炎、抗氧化以及調(diào)節(jié)免疫功能作用，槲皮素、山柰酚和木犀草素對NAFLD肝損傷有一定作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以改善NAFLD模型鼠的炎癥、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝及肝組織損傷[24-26]；木犀草素可以通過減少氧化損傷、調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因發(fā)揮護(hù)肝作用[27-28]；山柰酚可改善高脂飲食引發(fā)的血脂紊亂，并能干預(yù)脂肪肝的形成[29]。

通過分析發(fā)現(xiàn)，化滯柔肝顆粒治療NAFLD的核心靶點(diǎn)中，IL-6、IL-1β和TNF對應(yīng)的炎癥因子可參與各種炎癥反應(yīng)，刺激趨化因子CXCL8、CCL2的產(chǎn)生[30-32]。IL-6、IL-1β和TNF還可協(xié)同誘導(dǎo)VEGFA作用，促進(jìn)血管生成[33]。EGF可促進(jìn)細(xì)胞生長增殖、生存分化，如促進(jìn)免疫細(xì)胞分化，參與免疫調(diào)節(jié)；并對某些因子的生存具有一定的誘導(dǎo)作用，如VEGFA，從而加速新血管的生成[34-35]。TP53參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，可誘導(dǎo)生長停滯或細(xì)胞凋亡[36]。研究結(jié)果顯示，NAFLD發(fā)生時，TNF、IL-6、IL-1β和CCL2表達(dá)上調(diào)[37-38]；CXCL8、VEGFA與NAFLD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[39-40]。由此可見，本研究分析得到的關(guān)鍵化合物和核心靶點(diǎn)在化滯柔肝顆粒治療NAFLD的過程中發(fā)揮著重要作用。

GO功能富集分析與多元素網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果表明，肽-酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)可能是重要的生物過程，信號受體活化劑活性、受體配體活動和細(xì)胞因子受體結(jié)合可能是重要的分子功能。通路富集與多元素網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，作用的通路主要與傳染病、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌和代謝性疾病分類下的通路相關(guān)，其中人巨細(xì)胞病毒感染和AGE-RAGE信號通路可能是藥物發(fā)揮治療作用的重要通路。人巨細(xì)胞病毒受體-配體相互作用可刺激細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子、趨化因子、免疫受體和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)[41]。AGE/RAGE信號可誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活，從而導(dǎo)致NF-κB活性升高，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)和多種動脈粥樣硬化相關(guān)基因(如VEGFA)的表達(dá)[42]，還可參與細(xì)胞增殖和凋亡[43]。此外，有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制AGE-RAGE信號通路可在一定程度上改善NAFLD[44-45]。上述研究基本與本研究結(jié)果相似，在一定程度上說明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的可靠性。

八邊形節(jié)點(diǎn)代表中藥，正方形節(jié)點(diǎn)代表潛在成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，六邊形節(jié)點(diǎn)代表通路，菱形節(jié)點(diǎn)代表GO條目，內(nèi)部三角形節(jié)點(diǎn)代表GO條目分類，最外面三角形節(jié)點(diǎn)通路分類；節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)度值呈正相關(guān)octagonal nodes represent traditional Chinese medicine, square nodes represent potential components, circular nodes represent potential targets, hexagonal nodes represent pathways, diamond nodes represent GO items, inner triangular nodes represent GO items classification, outermost triangular nodes pathway classification; the size of the nodes is positively correlated with the node degree value圖5 化滯柔肝顆?！爸兴?關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-通路-GO條目”網(wǎng)絡(luò)Fig 5 Network diagram of “Traditional Chinese medicine-Key targets-Pathway-GO items” of Huazhi Rougan granules

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法研究了化滯柔肝顆粒對NAFLD的調(diào)控作用，體現(xiàn)了化滯柔肝顆粒多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，可為進(jìn)一步研究化滯柔肝顆粒的作用機(jī)制提供參考。但是，該方法由于數(shù)據(jù)庫不完全等原因，存在一定的局限性，只能提供初步的探索，后期仍需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。