劉翠華，趙方新，孫鵬，紅梅，武建強，張烜

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059

肺癌（lung cancer）的發(fā)病率和死亡率近年來一直高居各類惡性腫瘤之首，其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者比例占全部肺癌的85%以上［1］，具有易復(fù)發(fā)、預(yù)后差、生存率低等特點［2-3］，主要原因是早期診斷指標不足，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已發(fā)生局部或遠端轉(zhuǎn)移，患者的5 年總生存率在過去幾十年仍低于20%［4］。臨床數(shù)據(jù)表明，腫瘤轉(zhuǎn)移是NSCLC 治療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因之一［5］。因此，研究NSCLC 的轉(zhuǎn)移機制，發(fā)現(xiàn)有效的生物學標記和調(diào)控靶點對預(yù)防和治療NSCLC 具有重要意義。

RECK（reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs）基因是新型基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）抑制基因，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制多種MMP 的表達，也可抑制新生血管形成，從而抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移［6］。RECK 基因缺失時，MMP的過表達可導致細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度降解，血管及周圍組織完整性降低，促進新生血管形成；相反，RECK 基因高表達可抑制新生血管的形成。RECK 基因在大部分正常細胞株及正常組織中均有表達，但在多種腫瘤組織及細胞株中不表達［7-9］，上調(diào)RECK 基因可抑制腫瘤細胞的遷移和浸潤［10-11］，表明RECK 基因表達與腫瘤轉(zhuǎn)移抑制具有很好的相關(guān)性。此外，RECK 對腫瘤進展的影響受微小RNA（microRNA，miRNA）調(diào)控。CHEN 等［12］發(fā)現(xiàn)，miR-15b 通過靶向抑制RECK 來促進前列腺癌細胞的增殖和侵襲；miR-21 通過對RECK 的負調(diào)控作用，增強結(jié)腸癌細胞的侵襲和遷移能力［13］。

miRNA 是18 ～25 nt 的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過與靶基因mRNA 的5′或3′非翻譯區(qū)互補結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因mRNA 的穩(wěn)定性或干擾其蛋白翻譯，參與基因表達調(diào)控［14］。miRNA 與腫瘤發(fā)生及發(fā)展相關(guān)，可通過調(diào)控其靶基因抑制或促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等［15-16］。miR-455-5p 是近年發(fā)現(xiàn)的可參與調(diào)控多種惡性腫瘤進程的miRNA，在前列腺癌、肝癌、胃癌和宮頸癌中［17-20］，miR-455-5p 可通過抑制癌細胞生長、遷移等發(fā)揮抑癌基因功能；而在結(jié)腸癌［21］、乳腺癌［22-23］和口腔鱗狀細胞癌［24］中，miR-455-5p 可促進癌細胞增殖、遷移等惡性進程。另有報道，miR-455-5p 可通與其靶基因或與長鏈RNA 作用促進NSCLC 惡性進展［25-26］，但其是否可靶向RECK 基因參與調(diào)控肺癌遷移尚不清楚。

本研究首先通過生物信息學在線網(wǎng)站預(yù)測miR-455-5p 與RECK 基因的靶向關(guān)系，并進行驗證；再進一步探討miR-455-5p 靶向RECK 對人NSCLC 細胞A549 遷移及微血管形成的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及載體 人NSCLC 細胞系A(chǔ)549 和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）購自中科院上海細胞庫；pGL3-control 熒光素酶報告基因載體和pRL-TK 海腎熒光素酶載體由南開大學惠贈。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、F12K 培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS、氨芐青霉素和鏈霉素均購自美國GIBCO 公司；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基EGM 購自瑞士Lonza 公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司；總RNA 抽提純化試劑盒、cDNA 特異性反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA 特異性反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR SuperMix、RIPA 蛋白質(zhì)裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和ECL 發(fā)光液均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；miR-455-5p 模擬物、miR-455-5p 抑制劑和miRNA 陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；兔抗人REKC 單抗、MMP9 單抗、MMP2 單抗、小鼠抗人β-actin單抗、HRP 標記的羊抗兔和羊抗小鼠IgG 購自美國CST 公司；TranswellTM小室購自美國Corning 公司；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-A ELISA 檢測試劑盒購自北京達科為生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)膠Matrigel 購自美國BD 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual-luciferase?repoter assay system）購自美國Promega 公司。

1.3 miR-455-5p 與RECK 基因靶向關(guān)系預(yù)測 利用UALCAN 網(wǎng)站［27］（http：／ ／ ualcan.path.uab.edu ／）在線分析TCGA 數(shù)據(jù)庫資源，獲取肺癌中miR-455-5p 和RECK 基因表達水平的臨床數(shù)據(jù)，采用mi-Randa［28］（http：／ ／ www.microrna.org）預(yù)測miR-455-5p 與RECK 基因的靶向相關(guān)性。

1.4 細胞培養(yǎng) A549 細胞用含10%FBS、100 μg／mL鏈霉素、100 U ／ mL 氨芐青霉素的F12K 培養(yǎng)基，于5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)；HUVEC 用含10% FBS的EGM 培養(yǎng)基，于5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.5 A549 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的A549 細胞，按每孔3 × 105個接種于6 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，當細胞達70% ~ 80%匯合時，更換為Opti-MEM 培養(yǎng)基。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，用LipofectamineTM2000分別將miRNA 陰性對照（miR-NC 組）、miR-455-5p模擬物（miR-455-5p 組）及miR-455-5p 模擬物+miR-455-5p 抑制劑（inh-455-5p 組）瞬時轉(zhuǎn)染至A549 細胞，設(shè)未轉(zhuǎn)染組（Blank），37 ℃培養(yǎng)6 h 后更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進行后續(xù)試驗。

1.6 miR-455-5p 與RECK 基因直接靶向關(guān)系驗證采用雙熒光素酶報告基因試驗。根據(jù)生物信息學預(yù)測結(jié)果，將含有miR-455-5p 結(jié)合位點的RECK 3′UTR 野生型（Wild type）和突變型（Mutant）序列構(gòu)建至pGL3-control 熒光素酶報告基因載體的熒光素酶基因下游。將構(gòu)建好的RECK 3′UTR 野生型或突變型重組質(zhì)粒分別與miR-455-5p 模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至A549 細胞中。轉(zhuǎn)染24 h 后，收集細胞，按雙熒光報告基因檢測試劑盒說明書進行操作，利用多功能酶標儀讀取熒光值，并計算相對熒光活性，以miR-NC 組為基準進行歸一化處理。

1.7 A549 細胞中miR-455-5p 及RECK 基因表達的檢測 采用實時定量PCR（qRT-PCR）法。使用Primer premier 5 軟件設(shè)計引物，引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用總RNA抽提純化試劑盒提取各組轉(zhuǎn)染細胞中總RNA，分別用miRNA 特異性反轉(zhuǎn)錄試劑盒及總RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 中的miRNA 及mRNA 合成cDNA。以cDNA 為模板，用特異性引物，按照SYBR Green qPCR SuperMix 試劑盒說明書，采用qRT-PCR 法檢測miR-455-5p 及RECK 基因mRNA 的表達。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個循環(huán)。分別以U6 和GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.8 A549 細胞中RECK、MMP2 及MMP9 蛋白表達的檢測 采用Western blot 法。收集轉(zhuǎn)染48 h 后的A549 細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min；4 ℃，12 000 × g 離心20 min，取上清，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 蛋白樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE 分離后，通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含3% BSA 的TBST 液室溫封閉1 h；TBST洗滌后，加入兔抗人RECK、MMP2、MMP9 抗體（均1 ∶1 000 稀釋）、小鼠抗人β-actin 抗體（1 ∶2 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入HRP 標記的羊抗兔、羊抗小鼠IgG（1 ∶500 稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入ECL 發(fā)光液，于凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像，利用QuantityOne 軟件分析條帶灰度值，并以未轉(zhuǎn)染組為基準進行歸一化處理。

1.9 A549 細胞遷移能力的檢測 采用TranswellTM小室試驗。選用膜孔徑為8 μm 的24 孔板TranswellTM小室，將轉(zhuǎn)染后的A549 細胞饑餓培養(yǎng)12 h，用0.25%胰蛋白酶消化后，用無血清、含0.2% BSA 的F12K培養(yǎng)基重懸并計數(shù)。取細胞懸液100 μL（含1 ×105個細胞）加入TranswellTM小室的上室，下室加入含10% FBS 的F12K 培養(yǎng)基500 μL，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；用棉簽擦去TranswellTM小室膜內(nèi)側(cè)細胞，PBS 洗滌后，用95%乙醇室溫固定20 min；除去固定液并晾干，用0.1%結(jié)晶紫溶液室溫避光染色20 min；清水洗去多余染色液，倒置風干，100 倍顯微鏡下隨機選取5 個視野觀察拍照，Image J 軟件分析遷移細胞數(shù)，并以未轉(zhuǎn)染組為基準進行歸一化處理。

1.10 A549 細胞培養(yǎng)上清中VEGF-A 表達的檢測采用ELISA 法。分別收集各組A549 細胞72 h 后的培養(yǎng)液，4 ℃，2 500 × g 離心20 min，取上清，采用VEGF-A ELISA 試劑盒檢測VEGF-A 的分泌量，按試劑盒說明書操作。

1.11 體外微管形成試驗 將基質(zhì)膠Matrigel 按60 μL ／ 孔平鋪于預(yù)冷的96 孔板上，37 ℃放置1 h待凝。收集培養(yǎng)的HUVEC，PBS 洗滌2 次，分別用miR-455-5p、inh-455-5p 及miR-NC 組A549 細胞培養(yǎng)液上清重懸HUVEC，并接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的96 孔板，每孔1×104個細胞，置于37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)15 h。通過倒置顯微鏡觀察成管情況，Image J 軟件分析形成的微管結(jié)構(gòu)，并統(tǒng)計管總長度，以未轉(zhuǎn)染組為基準進行歸一化處理。

1.12 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件處理數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-455-5p 與RECK 基因的相關(guān)性 利用UALCAN 網(wǎng)站對TCGA 數(shù)據(jù)庫資源進行在線分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，肺癌組織中miR-455-5p 的表達顯著升高（t = -2.889，P = 0.044），而RECK 基因的表達顯著降低（t = 3.320，P = 0.029），二者表達呈負相關(guān)，見圖1。miRanda 預(yù)測結(jié)果表明，miR-455-5p 在RECK 基因mRNA 的3′-UTR 區(qū)域第97 ～106位堿基處存在與miR-455-5p 的結(jié)合域，見圖2，表明miR-455-5p 可能對RECK 基因有靶向調(diào)控作用。

圖1 正常組織和肺癌腫瘤組織中miR-455-5p（A）和RECK 基因（B）的表達Fig.1 Expressions of miR-455-5p（A）and RECK（B）genes in normal and lung cancer tissues

圖2 miR-455-5p 與RECK 基因靶向關(guān)系預(yù)測Fig.2 Prediction of targeted relationship between miR-455-5p and RECK

2.2 miR-455-5p 與RECK 基因的直接靶向關(guān)系 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-455-5p 模擬物與RECK 3′-UTR 野生型共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（t = 8.734，P =0.001）；而結(jié)合位點突變后，miR-455-5p 對熒光素酶活性的抑制作用消失，與miR-NC 和突變型共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（t = 0.222，P = 0.835）。見圖3。因此，RECK 基因為miR-455-5p 直接調(diào)控靶點。

圖3 miR-455-5p 與RECK 基因的靶向關(guān)系驗證Fig.3 Validation for targeted relationship between miR-455-5p and RECK

2.3 miR-455-5p 對A549 細胞中RECK 基因表達的調(diào)控 qRT-PCR 及Western blot 分析顯示，與Blank和miR-NC 組相比，miR-455-5p 組miR-455-5p 的表達水平明顯升高（F = 38.085，P 均為0.001），RECK基因mRNA 及蛋白的表達水平均顯著下調(diào)（F 分別為53.54 和18.502，P 均＜0.001 或= 0.002），而inh-455-5p 組各自表達均有所恢復(fù)（F 分別為53.54 和18.502，P 均＜0.001 或= 0.002），見圖4 ～圖6。提示miR-455-5p 對RECK 基因具有負調(diào)控作用。

圖4 各組A549 細胞中miR-455-5p（A）和RECK（B）基因mRNA 的表達水平Fig.4 Expression levels of miR-455-5p（A）and RECK（B）mRNAs in A549 cells of various groups

圖5 Western blot 分析各組A549 細胞中RECK 蛋白的表達Fig.5 Western blotting for expression of RECK protein in A549 cells of various groups

圖6 各組A549 細胞中RECK 蛋白表達量的半定量分析Fig.6 Semi-quantitative analysis for expression levels of RECK protein in A549 cells of various groups

2.4 miR-455-5p 對A549 細胞遷移能力的影響TranswellTM小室試驗顯示，與Blank 組和miR-NC 組相比，miR-455-5p 組A549 細胞的遷移能力明顯增強（F = 465.824，P 均＜0.001），而inh-455-5p組這種增強作用受到抑制（F = 465.824，P ＜0.001），見圖7 和圖8。表明miR-455-5p 可促進A549 細胞遷移。

圖7 顯微鏡下觀察各組A549 細胞的穿膜情況（結(jié)晶紫染色，× 100）Fig.7 Microscopy of transmembrane for A549 cells in various groups（crystal violet staining，× 100）

圖8 各組A549 細胞的遷移細胞數(shù)Fig.8 Numbers of migrated A549 cells in various groups

2.5 miR-455-5p 對A549 細胞MMP2 和MMP9 蛋白表達的影響 Western blot 分析顯示，與Blank 組和miR-NC 組相比，miR-455-5p 組A549 細胞中MMP2和MMP9 蛋白的表達水平均顯著上調(diào)（F 分別為56.121 和58.769，P 均＜0.001），而inh-455-5p 組上調(diào)受到顯著抑制（F 分別為56.121 和58.769，P均＜0.001）。見圖9 和圖10。

圖9 Western blot 分析各組A549 細胞中MMP2 和MMP9蛋白的表達Fig.9 Western blotting for expressions of MMP2 and MMP9 in A549 cells of various groups

圖10 各組A549 細胞中MMP9（A）和MMP2（B）蛋白表達量的半定量分析Fig.10 Semi-quantitative analysis for expression levels of MMP9（A）and MMP2（B）in A549 cells of various groups

2.6 miR-455-5p 對A549 細胞培養(yǎng)上清中VEGF-A表達的影響 ELISA 檢測結(jié)果顯示，與Blank 組和miR-NC 組相比，miR-455-5p 組A549 細胞培養(yǎng)上清中VEGF-A 分泌量顯著增加（F = 182.644，P 均＜0.001），而inh-455-5p 組VEGF-A 分泌量的增加受到顯著抑制（F = 182.644，P ＜0.001）。見圖11。

圖11 各組A549 細胞培養(yǎng)上清中VEGF-A 的分泌Fig.11 Secretion of VEGF-A in culture supernatant of A549 cells of various groups

2.7 miR-455-5p 對微血管形成的影響 miR-455-5p 組形成的微血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更完整，見圖12；Image J 軟件分析顯示，miR-455-5p 組微管總長度顯著高于Blank 組和miR-NC 組（F = 47.61，P 均＜0.001），見圖13。

圖12 顯微鏡下觀察微管形成情況（× 100）Fig.12 Microscopy for microvascular angiogenesis（× 100）

圖13 各組相對微管總長度Fig.13 Relative total capillary lengths in various groups

3 討 論

研究表明，miRNA 參與調(diào)控細胞發(fā)育、生長、增殖、凋亡、分化及代謝等重要生物學行為，且與疾病發(fā)生相關(guān)。miRNA 的異常表達與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌和血液系統(tǒng)腫瘤等，約50%經(jīng)驗證的miRNAs 在基因組上定位于腫瘤相關(guān)的脆性位點［29］。因此，miRNA作為分子標志物在腫瘤診斷和治療新技術(shù)的開發(fā)中具有很大潛力，研究其在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其作用機制，對腫瘤的診療及抗腫瘤藥物開發(fā)具有重要意義。miRNAs 在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用，可作為促癌基因誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化，也可作為抑癌基因參與抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展［15-16］。miR-455-5p 在卵巢癌和膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)為抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和進展［17-20］，而在胰腺癌、結(jié)腸癌、尤因氏肉瘤及乳腺癌中，則發(fā)揮促腫瘤作用［21-24］。據(jù)報道，miR-455-5p 在NSCLC 組織及順鉑耐藥的肺癌細胞株中呈高表達［25-26］。UALCAN 為一個全面的、交互式網(wǎng)絡(luò)資源［27］，用于分析公開的癌癥組學數(shù)據(jù)，可實現(xiàn)TCGA數(shù)據(jù)庫的在線分析和挖掘。本研究利用UALCAN網(wǎng)站對TCGA 數(shù)據(jù)庫資源進行在線分析也顯示，miR-455-5p 在肺癌組織中呈明顯高表達，提示miR-455-5p 可能與NSCLC 惡性進展相關(guān)，但具體作用及其機制尚不清楚。miRNA 對細胞功能的作用是通過調(diào)控其靶基因表達實現(xiàn)的，同一個miRNA 可調(diào)控多個靶基因，同一個基因也可受多個miRNA 的調(diào)控，形成真核生物復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究通過miRanda 對miR-455-5p 的靶基因進行在線預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在RECK 基因mRNA 的3′-UTR 區(qū)存在與miR-455-5p 的結(jié)合域，表明miR-455-5p 可能對RECK 基因有靶向調(diào)控作用。但miR-455-5p 是否通過與RECK 基因直接結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用尚不清楚。本研究構(gòu)建了RECK 3′-UTR 野生型或突變型熒光素酶報告基因重組載體，通過雙熒光素酶報告基因試驗證明了RECK 基因為miR-455-5p 的直接調(diào)控靶基因。

RECK 為一種新型的MMP 抑制基因［6］，通過抑制多種MMP 的表達抑制新生血管形成，從而抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。MMP 是一類能降解ECM 的蛋白水解酶，其中研究較多的是MMP2 和MMP9，通過降解外基質(zhì)，導致腫瘤周圍組織完整性降低，促進新生血管形成及腫瘤細胞的侵襲遷移［30］，提示miR-455-5p 可能會通過抑制RECK 的表達而調(diào)控細胞的遷移。

本研究通過在A549 細胞中轉(zhuǎn)染miR-455-5p 模擬物發(fā)現(xiàn)過表達miR-455-5p 會抑制RECK 基因的表達，而TranswellTM小室試驗顯示，miR-455-5p 可促進A549 細胞遷移。同時發(fā)現(xiàn)miR-455-5p 可上調(diào)MMP2 及MMP9 的表達，提示miR-455-5p 可能對腫瘤微血管形成有影響。腫瘤血管新生是肺癌轉(zhuǎn)移的必要條件［31］，目前在體外研究血管新生最常用的方法是微管形成試驗，在培養(yǎng)板上鋪上Matrigel 以模擬基底膜，通過觀察內(nèi)皮細胞在Matrigel 上分化形成管形結(jié)構(gòu)的能力反映微血管生成能力。VEGF-A是誘導內(nèi)皮細胞分化形成新血管的關(guān)鍵因子，本研究通過ELISA 法檢測了A549 細胞培養(yǎng)液中VEGF-A的分泌量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-455-5p 模擬物可顯著升高培養(yǎng)液中VEGF-A 的濃度；用此培養(yǎng)液刺激HUVEC 后發(fā)現(xiàn)，miR-455-5p 模擬物組誘導HUVEC分化形成微管的能力明顯高于對照組，從形成管腔結(jié)構(gòu)的完整性和管總長度分析均表明，miR-455-5p可通過上調(diào)A549 細胞VEGF-A 的分泌從而誘導微血管的形成。上述研究證明，miR-455-5p 通過下調(diào)RECK 表達，上調(diào)MMP2、MMP9 及VEGF-A 的表達促進A549 細胞的遷移及微血管形成。

綜上所述，miR-455-5p 可通過直接負調(diào)控RECK基因，上調(diào)MMPs 和VEGF-A 表達及分泌，進而促進NSCLC 細胞遷移及微血管形成能力，表明miR-455-5p 可作為促癌因子在NSCLC 惡性進展中發(fā)揮作用，是NSCLC 轉(zhuǎn)移的一種潛在分子機制。本研究為NSCLC 的臨床預(yù)防、診斷和治療提供了新的思路。