蔡美娜 綜述，許四宏 審校

1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100730；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

狂犬病由狂犬病病毒感染引起，為高度嗜神經(jīng)性的人畜共患傳染病，全球每年約59 000 人死于該病，其中亞洲和非洲占絕大部分［1］?？袢〔《局饕嬖谟谑芨腥緞游锏耐僖褐?，通過受感染動物咬傷或舔舐宿主受損皮膚進行傳播。人感染狂犬病病毒后，一旦發(fā)病，會出現(xiàn)恐水、焦慮、狂躁、吞咽肌強直、吞咽困難、流涎、失眠、遲緩性麻痹等臨床癥狀，死亡率幾乎為100%［2］，全球僅有6 例治愈病例［3］。

狂犬病病毒屬于彈狀病毒科、狂犬病病毒屬成員，成熟的病毒顆粒呈典型的子彈狀，頭部呈半球形，末端為截面型，直徑約75 nm，長100 ~ 300 nm?？袢〔《净蚪M是不分節(jié)段的單股負鏈RNA，全長約12 000，從3′至5′端依次為N、P、M、G 和L 基因?？袢〔《咎堑鞍祝℅）作為狂犬病病毒唯一的膜蛋白，是組成病毒囊膜表面的主要蛋白，含2 ~ 4個糖基化位點，通過與靶細胞結(jié)合介導(dǎo)病毒侵染，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的最主要抗原，在機體免疫中起關(guān)鍵作用［4-5］。

狂犬病是一種高致病性傳染病，感染后如不及時治療，經(jīng)過一定潛伏期即可發(fā)病，最終導(dǎo)致死亡。利用WHO 推薦的暴露后預(yù)防（post-exposure proph-ylaxis，PEP）法迅速處理患者，可有效阻止疾病發(fā)生。PEP 包括3 個步驟：迅速清理傷口，注射抗狂犬病病毒免疫球蛋白（rabies immunoglobulin，RIG），接種狂犬病疫苗［6-7］。

目前，RIG 是通過接種狂犬病疫苗的人或馬的血漿獲得，稱為人RIG（human RIG，HRIG）或馬RIG（equine RIG，ERIG）。常規(guī)的RIG 具有成本高、供應(yīng)量有限以及安全性等問題，因此，考慮利用成本低并可大規(guī)模生產(chǎn)的單克隆抗體（MAb）來代替RIG。KUZMINA 等［8］經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)，針對非重疊表位的2 個或多個MAb 不會出現(xiàn)相同的病毒逃逸突變株，因此建議聯(lián)合使用針對狂犬病病毒G 蛋白上至少2 個非重疊表位的MAb 來克服當(dāng)前RIG 存在的缺陷，并同時保持有效交叉保護的廣度。鑒于狂犬病病毒G 蛋白是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體的主要抗原，本文對G 蛋白的結(jié)構(gòu)以及可用于替代RIG 的具有廣譜中和活性的候選MAb 的研究進展作一綜述，為單抗雞尾酒（MAb cocktail）療法抗體組合的研究提供參考。

1 G 蛋白的結(jié)構(gòu)及抗原表位

G 蛋白屬于以同源三聚體形式存在的Ⅰ型跨膜蛋白，由1 575 個堿基組成，可編碼524 個氨基酸，其中N 端第1 ~ 19 位氨基酸為信號肽，在病毒轉(zhuǎn)錄過程中被切除［9］，切除信號肽的G 蛋白還需經(jīng)過在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和胞質(zhì)膜上發(fā)生糖基化等內(nèi)在化修飾才能成為成熟的G 蛋白［10］；其中最主要的糖基化位點是第37 和319 位氨基酸上的位點。成熟的G 蛋白不含信號肽，由505 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為56 000，等電點為6.7，包括3 個區(qū)域（膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)）。膜外區(qū)由第1 ~ 439 位氨基酸構(gòu)成，該區(qū)域可識別宿主細胞上的受體，介導(dǎo)病毒膜與宿主膜融合并含有最主要的抗原位點，具有強免疫原性和抗原性。跨膜區(qū)由第440 ~ 461 位氨基酸構(gòu)成，位于病毒顆粒表面，參與G 蛋白嵌入病毒包膜中。膜內(nèi)區(qū)由第462 ~ 505 位氨基酸構(gòu)成，位于病毒包膜內(nèi)，可與M 和N 蛋白相互作用。

成熟G 蛋白上主要抗原位點有GⅠ、GⅡ、GⅢ、G5 及Ag［11-12］，其中GⅠ位于第226 ~ 231 位氨基酸殘基區(qū)段，既包括空間構(gòu)象抗原位點又包括線性抗原位點；GⅡ是典型的不連續(xù)性的空間構(gòu)象表位，2 個主要抗原位點GⅡa（第34 ~ 42 位氨基酸）和GⅡb（第198 ~ 200 位氨基酸）通過二硫鍵相互連接；GⅢ作為最主要的抗原位點，位于第330 ~ 338位氨基酸區(qū)段，為構(gòu)象依賴性表位，另外此區(qū)域R333 是狂犬病病毒神經(jīng)毒性相關(guān)位點［13］；次要位點aG，位于第342 ~ 343 位氨基酸區(qū)段，與GⅢ相鄰；G5 位于261 ~ 264 位氨基酸區(qū)段，是高度保守的線性表位，免疫原性較弱。見圖1。近年來隨著分子生物學(xué)及計算生物學(xué)的發(fā)展，G 蛋白上其他抗原表位被分離鑒定出，如第14 ~ 19 位氨基酸區(qū)段表位序列為WxxxDI 的N-末端線性表位［14］，圍繞第251 位氨基酸殘基的GⅤ及GⅥ表位（位于第264位氨基酸）［8］。

圖1 狂犬病病毒G 蛋白上抗原位點示意圖Fig.1 Antigen epitopes of rabies virus glycoprotein

基于PEP 中RIG 存在的問題，利用易獲得、中和效果好的MAb 替代RIG 是理想的選擇。由于狂犬病病毒的自然變異性，尤其是在MAb 中和表位存在的變異性，建議至少2 個MAb 同時使用以確保治療效果等于或強于RIG。在篩選用于雞尾酒療法的MAb 時應(yīng)遵循以下標準［15-16］：①選擇的MAb應(yīng)針對不同的中和表位且表位不重疊；②選擇的MAb 要具有高效中和活性和廣譜性；③選擇的MAb 組合與疫苗聯(lián)合使用可保護動物免受致死劑量狂犬病病毒的攻擊；④選擇的MAb 組合對疫苗的干擾作用不應(yīng)超過當(dāng)前使用的血清產(chǎn)品?；谝陨显瓌t，以下將詳細介紹有希望替代RIG 的MAb組合。

2 17C7（Rabishield ／ RAB1 ／ SIIR MAb）

17C7 抗體是第一個無需與其他抗體組合即可替代RIG 的MAb，2016 年在印度注冊并于2017年上市［16-17］。SLOAN 等［18］利用狂犬病疫苗（Rab-AvertTM或Imovax?）免疫轉(zhuǎn)基因小鼠（轉(zhuǎn)入人免疫球蛋白基因），共篩選到27 個人源MAb，其中僅17C7 MAb 可中和在美洲、非洲和亞洲等地不同物種中分離出的44 種狂犬病病毒街毒株；并且在PEP動物體內(nèi)模型中與疫苗聯(lián)用可保護倉鼠免受致死劑量狂犬病病毒的攻擊。17C7 MAb 與G 蛋白親和力為13 nM，可識別G 蛋白上的空間依賴性位點Ⅲ，其中關(guān)鍵氨基酸殘基位點為N336 和R346。WANG等［19］發(fā)現(xiàn)，只有在這兩個關(guān)鍵氨基酸殘基位點同時存在突變時（N336D ／ R346K），17C7 才不表現(xiàn)對狂犬病病毒的中和作用；在GenBank 中共檢測到469條完整的狂犬病病毒G 蛋白序列，沒有任何1 條G蛋白序列中同時存在第336 和346 位氨基酸的突變。因此，證明此單一MAb 應(yīng)足夠中和所有狂犬病病毒街毒株。

3 CL184

CL184 現(xiàn)已完成臨床Ⅰ期和Ⅱ期試驗。Ⅰ期臨床試驗結(jié)果表明，該產(chǎn)品安全且具有良好的耐受性，在20 或40 IU ／ kg 劑量的受試者中均產(chǎn)生足夠的狂犬病病毒中和抗體（rabies virus neutralizing antibody，RVNA）水平，但Ⅱ期臨床試驗結(jié)果并未對外公布；2011 年該產(chǎn)品退出臨床試驗［20］。CL184 由CR57和CR4098 這兩種人源抗狂犬病病毒的MAb 組成，其中CR57MAb 由DIETZSCHOLD 等［21］在接種狂犬病疫苗的志愿者的B 細胞中分離出來，之后，MARISSEN 等［22］利用PER.C6?表達系統(tǒng)將抗體重新表達，形成人源IgG1 型抗體——CR57。利用表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）方法測得CR57 MAb 對G 蛋白結(jié)合的親和力為2.4 nmol／L，可識別G 蛋白上的線性表位Ⅰ，其中關(guān)鍵氨基酸殘基為第226、228、229 和230 位。通過對229 條不同來源的狂犬病病毒G 蛋白序列分析顯示，位點Ⅰ是高度保守的［15］。另外通過體外中和試驗證實，CR57 MAb 可中和24 個狂犬病病毒街毒株，僅存在2 個逃逸株［23］?；陔u尾酒療法MAb 選擇標準，為了尋找與CR57 MAb 表位不重疊、中和作用互補的MAb，KRAMER 等［24］通過接受狂犬病疫苗免疫的志愿者血細胞中獲得的抗體基因構(gòu)建了噬菌體抗體庫；利用滅活狂犬病病毒、純化狂犬病病毒G 蛋白和PER.C6 細胞表面表達狂犬病病毒G 蛋白進行篩選，最終分離鑒定出39 個對狂犬病病毒具有中和活性的scFv 片段，綜合VH 和VL 基因種系及對狂犬病病毒的中和活性，將39 個scFv 片段中21 個轉(zhuǎn)化為全長人IgG1，其中14 個抗體的中和效能指標＞500 IU ／ mg（中和效能＞500 IU ／ mg 時，無論在體外或體內(nèi)MAb 均能有效中和狂犬病病毒街毒株）。隨后，BAKKER 等［23］進一步研究了這些抗體對可逃逸CR57 中和作用的狂犬病病毒街毒株的中和效果，篩選出了CR4098 MAb。CR4098 MAb 與G 蛋白的親和力為4.5 nmol／L，可識別G 蛋白上的空間構(gòu)象位點Ⅲ，逃逸位點為N336D，可中和26 個狂犬病病毒街毒中的24 個，未能中和的狂犬病病毒街毒株可被CR57 MAb 有效中和。CHANG 等［25］通過對現(xiàn)有主要的狂犬病病毒G 蛋白序列分析后發(fā)現(xiàn)，沒有任何1 個狂犬病病毒株會同時出現(xiàn)CR57 和CR4098 結(jié)合位點的突變。因此，CL184 可有效中和所有的狂犬病病毒街毒株。GOUDSMIT 等［26］在接受致死劑量狂犬病病毒攻擊的倉鼠模型中證明，CL184 和RIG 起到的保護作用以及對疫苗的干擾作用相當(dāng)。

4 RVC-20 ／ RVC-58

狂犬病病毒屬由狂犬病病毒及在蝙蝠體內(nèi)分離出的狂犬病相關(guān)病毒組成，主要分為Ⅰ和Ⅱ兩個遺傳譜系，還包括幾個新發(fā)現(xiàn)未分類的病毒（見表1［27］）。目前廣泛流行的狂犬病主要由遺傳譜系Ⅰ中的狂犬病病毒引起。雖然大多數(shù)狂犬病相關(guān)病毒與人類死亡無關(guān)，但全部能夠在動物及人類中引起致命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來，狂犬病相關(guān)病毒如EBLV1、EBLV2、ABLV、IRKV、DUVV 和MOKV 等引起了零星人類狂犬病病例，但現(xiàn)有商業(yè)化的RIG 對狂犬病相關(guān)病毒的中和活性有限［28］；同樣，上文提到的2種抗狂犬病病毒MAb CL184 和RAB1 也無法中和大多數(shù)狂犬病相關(guān)病毒。DE BENEDICTIS 等［29］在接受疫苗免疫的志愿者記憶B 細胞中分離鑒定出對狂犬病病毒具有廣譜中和活性抗體——RVC-20 和RVC-58，將2 個抗體聯(lián)合使用表現(xiàn)出比CL184 和RAB1 更高、更廣譜的體外中和活性，不僅可中和現(xiàn)有的35 種狂犬病病毒，還可中和包括EBLV1、EBLV2、ABLV、IRKV、DUVV 和MOKV 等在內(nèi)的25 種狂犬病相關(guān)病毒。RVC-20 MAb 識別狂犬病病毒G 蛋白上的抗原位點Ⅰ，與同識別位點Ⅰ的CR57 MAb 相比，RVC-20 MAb 具有更高、更廣譜的中和活性；RVC-58 識別位點為Ⅲ，與之前報道的CR4098 MAb 識別表位部分重疊，CR4098 MAb 不具備中和大部分狂犬病相關(guān)病毒的能力，但RVC-58 可中和遺傳譜系Ⅰ中所有的狂犬病相關(guān)病毒［25］。在受到致死劑量狂犬病病毒攻擊的敘利亞倉鼠模型中，0.045 mg ／ kg劑量的RVC-20 與0.045 mg ／ kg 劑量的RVC-58 聯(lián)合使用，在PEP 中起到與標準劑量HRIG（20 IU／kg）相同的保護作用，且不會干擾狂犬病疫苗接種后在動物體內(nèi)誘發(fā)的RVNA 的產(chǎn)生。綜上所述，RVC-20和RVC-58 MAb 用做狂犬病的雞尾酒療法，具有較好的應(yīng)用前景。

表1 狂犬病病毒屬病毒分類Tab.1 Classification of Lyssaviruses

5 SYN023

SYN023 因其具有的高效能及廣譜中和活性成為替代RIG 的候選者之一，是由CHAO 等［30］于2017 年提出的抗體組合。在動物體內(nèi)的試驗結(jié)果表明，SYN023 對10 株北美和15 株中國流行的狂犬病病毒的中和能力優(yōu)于HRIG，另外，在利用Tadaridabrasiliensis（一種在蝙蝠體內(nèi)分離出的狂犬病病毒）攻擊敘利亞倉鼠的模型中，SYN023 的劑量為0.03 mg／kg 時能夠提供與標準劑量HRIG（20 IU／kg）相同的保護作用。

SYN023 是由CTB011 MAb 與CTB012 MAb 按1 ∶1 比例組合而成。CHAO 等［30］首先利用狂犬病疫苗免疫BALB ／ c 小鼠獲得MAb 的雜交瘤，經(jīng)過與狂犬病病毒G 蛋白結(jié)合活性及對CVS-11 中和活性的雙重篩選，獲得5 個MAb，再經(jīng)競爭ELISA 確定了抗體組合——3D11E3 ／ 7G11A3。3D11E3 和7G11A3 屬于鼠源IgG2a 類抗體，為降低免疫原性，通過CDR 移植進行人源化，分別產(chǎn)生了MAb CTB011和CTB012，均為IgG1 型MAb；人源化MAb 與G 蛋白親和力分別為0.27 和0.31 nmol ／ L；抗體的中和活性在人源化前后未受影響。為了確定抗體的識別表位，對狂犬病病毒G 蛋白進行了全面的丙氨酸掃描誘變（alanine-scanning mutagenesis），結(jié)果顯示，CTB011 MAb 識別表位Ⅲ的邊緣，關(guān)鍵氨基酸殘基為N336、I339、E337 和H370；CTB012 MAb 識別表位屬于構(gòu)象表位，但不屬于現(xiàn)已知的任何一個表位，結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基為F2、P25、N26、T171 和E281。經(jīng)過對83 個狂犬病病毒株和47 個狂犬病相關(guān)病毒共130 個毒株G 蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，2 個MAb 在G 蛋白上的結(jié)合位點均高度保守；另外還發(fā)現(xiàn)，CTB012 可能中和多種狂犬病相關(guān)病毒（如EBLV1 和EBLV2 等），是RIG 及抗狂犬病病毒MAb CL184 和RAB1 無法比擬的。綜上所述，體外中和試驗、體內(nèi)動物試驗、大量毒株G 蛋白序列分析等結(jié)果以及CTB011 ／ CTB012 具有的較強的補體依賴的細胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC），足以證明了SYN023 成為狂犬病治療生物制劑的潛力。

6 NM57S ／ NC08

NM57S ／ NC08 是由我國華北制藥集團公司（North China Pharmaceutical Corporation，NCPC）與美國生物技術(shù)公司（Molecular Targeting Technologies，MTTI）合作在中國開發(fā)的，用于狂犬病暴露后治療的人抗狂犬病病毒MAb 產(chǎn)品［25］。NM57S ／ NC08 是最初在美國托馬斯·杰斐遜大學(xué)開發(fā)的2 種MAb，其中NM57S 和NC08 MAb 分別識別G 蛋白上的抗原位點Ⅰ、Ⅱ，二者體外可中和多種狂犬病病毒株，并可在動物功效模型中提供有效的保護作用?，F(xiàn)已完成Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗，于2018 年3 月正式開啟Ⅲ期臨床試驗［25，31-32］。

7 Rabimabs（62-71-3 ／ M777-16-3）

世界衛(wèi)生組織狂犬病協(xié)作中心（WHO Collaborating Centres for Rabies，WHO RCC）鑒定了5 種鼠源MAb，其中E559、M727-5-1、M777-16-3 和1112-1能識別G 蛋白的抗原位點Ⅱ，62-71-3 識別抗原性位點Ⅰ［29］。根據(jù)鼠源MAb 的中和效價、結(jié)合特異性以及對狂犬病病毒街毒株的中和效果和廣譜性等篩選標準，共獲得3 種MAb 雞尾酒組合，即62-71-2 ／E559、62-71-3 ／ M727-5-1 和62-71-3 ／ M777-16-3。在動物體內(nèi)，3 組鼠源MAb 構(gòu)成的雞尾酒均具有與HRIG 相同的功效，因此可認為是用于PEP 及預(yù)防人類狂犬病的潛在廉價生物替代藥物。M777-16-3由加拿大動物疾病研究所提供，62-71-3 由美國疾病控制與預(yù)防中心提供；Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗均已完成，根據(jù)Ⅰ期臨床試驗結(jié)果確定了Ⅲ期臨床中Rabimab劑量為40 IU ／ kg，試驗在印度13 家診所展開，目前結(jié)果正在分析中［31］。

8 E559 ／ 62-71-3

WHO RCC 鑒定了5 種鼠源MAb 組成的3 種可用于雞尾酒組合抗體之一，其中識別抗原位點Ⅱ的MAb 中，E559 抗體具有最強中和效價及最廣譜的中和活性，因此E559 是最重要的替代RIG 的候選Mab［32］。為了降低鼠源MAb 的免疫原性，VAN DOLLEWEERD 等［33］和BOTH 等［34］分別將E559和62-71-3 抗體進行人源化后形成了人鼠嵌合抗體，并利用植物表達系統(tǒng)成功在煙草中穩(wěn)定表達了人鼠嵌合抗體E559 和63-71-3。煙草中表達的E559和62-71-3 抗體在結(jié)構(gòu)、中和活性、中和廣譜性與通過雜交瘤細胞表達的鼠源MAb 無區(qū)別，在倉鼠攻擊模型中該嵌合抗體與商業(yè)化的HRIG 產(chǎn)品具有相同功效。植物表達系統(tǒng)也屬于真核表達系統(tǒng)，因為其具有與哺乳動物細胞類似的細胞內(nèi)機制，可正確折疊和組裝抗體等復(fù)雜蛋白質(zhì)［35-36］。隨后TSEKOA等［37］研究也證明了利用植物表達系統(tǒng)表達的E559 ／62-71-3 人鼠嵌合抗體是有效的；2 種MAb 均能在體外有效中和多種狂犬病病毒株；在倉鼠暴露后攻擊試驗?zāi)Ｐ椭?，與HRIG 相比，E559 和62-71-3 起到了更強的保護作用?？傮w來說，植物表達系統(tǒng)以其低廉的生產(chǎn)成本，植物組裝和修飾MAb 等多聚體蛋白的能力以及易于擴展的優(yōu)點成為了生產(chǎn)MAb 經(jīng)濟可行的平臺；利用植物平臺生產(chǎn)的E559 ／ 62-71-3抗體組合可作為預(yù)防人類狂犬病的廉價替代品，以使發(fā)展中國家的低收入家庭受益。

9 AR16 ／ CR57

AR16 是利用3 名接種狂犬病疫苗的志愿者的外周血淋巴細胞構(gòu)建噬菌體抗體庫，從中篩選出可特異性識別狂犬病病毒G 蛋白上G5 表位的新型人源單鏈抗體［38］。通過丙氨酸掃描誘變確定G5 表位內(nèi)對AR16 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基為261 ~ 263位氨基酸。研究者對220 個基因Ⅰ型狂犬病病毒株的G 蛋白第261 ~ 263 位氨基酸進行比對發(fā)現(xiàn)，AR16 結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基高度保守，表明AR16有廣譜中和狂犬病病毒株的潛質(zhì)。研究者還提出將AR16 與CR57 組合使用來替代PEP，CR57 識別表位Ⅰ與CR16 的表位不重疊，因此二者表位不存在競爭；另外，通過熒光抗體中和實驗（fluorescent antibody virus neutralisation test，F(xiàn)AVN）證明組合的CR57／AR16 中和效果高于單獨使用的CR57 或AR16，提示CR57 ／ AR16 組合可提高其中和能力［39］?；陔u尾酒療法抗體篩選標準，僅憑研究者提供的現(xiàn)有結(jié)果不足以證明CR57 與AR16 可組合使用，如果想進一步確定AR16 與CR57 的組合是否為理想的RIG 替代物，一方面要通過體外中和試驗確定2 個抗體對狂犬病病毒街毒株的中和情況，中和活性是否互補；另一方面要通過體內(nèi)動物模型確認2 個抗體聯(lián)合使用的效果不低于RIG 并對疫苗的干擾作用不高于RIG。

WHO 在2018 年4 月發(fā)表的關(guān)于狂犬病疫苗和免疫球蛋白的最新文件中指出，應(yīng)更加謹慎地使用RIG，并鼓勵使用MAb 產(chǎn)品代替RIG，開發(fā)包含2 種或多種表位不重疊的MAb 產(chǎn)品，以提高對狂犬病病毒株中和的效力和廣度［31］。已獲批及正處于臨床試驗階段的狂犬病病毒MAb 見表2。迄今為止，關(guān)于狂犬病病毒的MAb 發(fā)展最快的產(chǎn)品為印度PVT 血清研究所生產(chǎn)的Rabishield（2016 年獲批，2017 年上市）；另外還有4 種處于臨床試驗階段，其中Rabimabs 已經(jīng)完成Ⅲ期臨床試驗，數(shù)據(jù)正在分析中，而CL184 在完成Ⅰ、Ⅱ臨床后退出了產(chǎn)品開發(fā)。

表2 已獲批和正處于臨床試驗階段的狂犬病病毒MAb 產(chǎn)品Tab.2 MAbs against RV approved and in clinical trials

10 結(jié) 語

經(jīng)過對狂犬病病毒G 蛋白及其表位的多年研究，國內(nèi)外均報道了較多具有臨床應(yīng)用前景的抗狂犬病病毒MAb，這些MAb 將來必定會取代RIG。但在選擇可誘導(dǎo)MAb 生成具有中和活性MAb 表達系統(tǒng)時，需重點考慮所選表達系統(tǒng)中蛋白質(zhì)是否可發(fā)生正確折疊及糖基化。一旦獲得高效的中和性MAb后還應(yīng)進一步考慮其成藥性、生產(chǎn)成本、效率和純化的簡便性，以及產(chǎn)品質(zhì)量、數(shù)量和后續(xù)應(yīng)用安全性；另外，也有必要考慮臨床試驗和進入市場所需時間，以及相關(guān)法律法規(guī)。