陳瓊，王珊珊，呂雪艷，周學益，韓菲，張亭，葉強

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.成都生物制品研究所有限責任公司，四川 成都 610023；3.北京民海生物科技有限公司，北京 102600

肺炎球菌是一種條件致病菌，是侵襲性肺炎球菌疾病和社區(qū)獲得性肺炎的主要病原菌，也是腦膜炎、菌血癥、急性中耳炎和鼻竇炎的常見病因。老人和兒童是肺炎球菌感染高危人群。2015 年，在全球估計的583 萬5 歲以下兒童死亡病例中，約有294 000 例［不確定范圍（uncertain region，UR）：192 000 ～366 000］是由肺炎球菌感染引起的，另外，估計有23 300 例死亡（UR：15 300 ～40 700）發(fā)生在合并感染艾滋病病毒的兒童中［1］。發(fā)展中國家的疾病和死亡率高于工業(yè)化國家，大多數(shù)死亡發(fā)生在非洲和亞洲［2］；而且肺炎球菌感染也是導致老年人死亡的主要原因之一［3］。目前，肺炎球菌的耐藥性日趨嚴重，疫苗接種作為有效、經濟的預防方式已獲得廣泛認同［4］。

肺炎球菌莢膜多糖不僅是重要的毒力因子，而且作為肺炎球菌多糖疫苗的活性成分，具有型特異性，目前已發(fā)現(xiàn)90 多個血清型［5-6］?；钚猿煞郑ㄇv膜多糖）含量測定是保證肺炎球菌多糖疫苗質量有效穩(wěn)定的一項重要指標。目前，《中國藥典》三部（2020版）23 價肺炎球菌多糖疫苗各論中規(guī)定，各型多糖含量檢測采用速率比濁法［7］，因此，研制用于該方法的莢膜多糖國家參考品尤為重要。本研究制備了19A 型肺炎球菌多糖國家參考品，以期統(tǒng)一衡量不同來源的肺炎球菌多糖疫苗，確保不同企業(yè)生產的疫苗肺炎球菌莢膜多糖含量一致。

1 材料與方法

1.1 候選參考品 19A 型肺炎球菌多糖候選參考品（編號：PS19A-2020）由成都生物制品研究所有限責任公司提供。于2018 年9 月，將1 批19A 型肺炎球菌培養(yǎng)上清經收獲、殺菌、多糖粗制、多糖精制后，再進行除菌、溶解和分裝；分裝體積約為0.6 mL ／ 瓶，濃度（精糖粉末重量）為500 ～600 μg ／ mL，分裝量約為5 000 瓶，-70 ℃保存。

1.2 標準品、內部質控品及肺炎球菌19c因子血清 19A型肺炎球菌多糖標準品［批號：PN-PV-01Mar2016，20 μg ／（mL·型）］和內部質控品（批號：00118241.0000393）由Merck Sharp&Dohme Corp.，U.S.A 惠贈；肺炎球菌19c 因子血清購自丹麥血清研究所（Statens SerumInstitut，SSI）。

1.3 主要試劑及儀器 UDR、IMMAGE800 緩沖液、IMMAGE800 稀釋液、IMMAGE800 洗液及免疫化學分析系統(tǒng)（IMMAGE800 Immunochemistry System）均購自美國Beckman 公司；其他試劑為國產分析純。

1.4 候選參考品的質量分析 根據(jù)《中國藥典》三部（2020 版）中23 價肺炎球菌多糖疫苗各論對候選參考品進行質量分析［7］；采用1H 核磁共振法對候選參考品進行型別鑒定，并與文獻［8］報道的19A 型肺炎球菌多糖核磁指紋特征圖譜進行比較。

1.5 多糖含量協(xié)作標定

確定協(xié)作標定操作規(guī)范，選取中國食品藥品檢定研究院（編號：01）、成都生物制品研究所有限責任公司（編號：02）及北京民海生物科技有限公司（編號：03）3 家實驗室，標定候選參考品的多糖含量。每個實驗室至少獲得5 個獨立數(shù)據(jù)，每個獨立數(shù)據(jù)為3 個稀釋度的均值，每個稀釋度需進行2 次平行檢測。實驗有效性前提為標準曲線相關系數(shù)（R2）不小于0.99，且2 次平行測定值的RSD 不大于15%，內部質控品的19A 型多糖含量在35 ～65 μg ／ mL。最終結果為3 家實驗室15 個獨立數(shù)據(jù)計算均值及RSD。

1.5.1 儀器參數(shù)設置 選擇Non-Competitive Neph.模 式，Sample or Dilution Volume 21 μL，Reaction Buffer Volume 300 μL，Compartment A Volume 21 μL，Compartment B Volume 0，Gain 4，Cal Dilution 1 ∶1，反應時間3.5 min。

1.5.2 稀釋方案 統(tǒng)一分發(fā)多糖標準品、內部質控品、血清和候選參考品給3 家協(xié)作實驗室。將10 μg ／ mL 標準品用IMMAGE800 稀釋液稀釋至4個標定濃度（0.75、1.0、1.5 和2.0 μg ／ mL）；內部質控品40 倍稀釋；候選參考品稀釋方法見表1，選擇3 個稀釋度供檢測。

表1 候選參考品稀釋方法（μL）Tab.1 Dilution of candidate（μL）

1.6 分裝均勻性評估 隨機抽取所需進行均勻性評估的參考品50 瓶，采用IMMAGE800 稀釋液將候選參考品稀釋至1 ∶500 供檢測。

1.7 穩(wěn)定性評估 將候選參考品分別于2 ～8 ℃放置2、4 和8 周，25 ℃放置3、7、14、21 和28 d，37 ℃放置6 h、1 d、2 d、3 d、7 d 和14 d；反復凍融3 次，以-70 ℃超低溫冰箱中保存的參考品作為對照，測定其含量，考察參考品的加速穩(wěn)定性及反復凍融穩(wěn)定性。

2 結 果

2.1 候選參考品的質量 候選參考品的各項檢測結果均符合《中國藥典》三部（2020 版）的標準，見表2。PS19A-20201H 核磁譜圖端基質子區(qū)各峰的化學位移與19A 型肺炎球菌多糖核磁指紋特征圖譜一致，見圖1。因此，候選參考品為19A 型肺炎球菌多糖。

圖1 19A 型肺炎球菌莢膜多糖600 MHz 1H NMR 端基質子區(qū)圖譜Fig.1 600 MHz 1H NMR anomeric proton regions of serotype 19A pneumococcal capsular polysaccharide

表2 候選參考品的質量分析結果Tab.2 Quality analysis of candidate reference

2.2 多糖含量協(xié)作標定 3 家實驗室標準曲線R2均大于99%，各濃度2 次平行測定值的RSD 均小于10%。由3 個稀釋度獲得每次獨立數(shù)據(jù)的RSD 均小于5%。3 家實驗室獲得的15 次標定結果的均值為565 μg ／ mL，RSD 為8.56%。內部控制品的多糖含量均符合標準，見表3。

表3 各實驗室協(xié)作標定結果（μg ／ mL）Tab.3 Collaborative calibration results by various laboratories（μg ／ mL）

2.3 分裝均勻性 隨機抽取的50 瓶候選參考品19A 型多糖含量在535 ～622 μg ／ mL 之間，均值為586 μg ／ mL，最高值與最低值的RSD 為10.63%，50 瓶多糖含量的RSD 為3.16%，分裝均勻性良好。

2.4 穩(wěn)定性 19A 型多糖在37 ℃下存放3 d，多糖含量從第0 天的620 μg ／ mL 下降至545 μg ／ mL，標準偏差（standard deviation，STD）為9.10%；7 d 時多糖含量為404 μg／mL，STD 為29.83%。25 ℃下存放14 d，多糖含量從第0 天的620 μg／mL 下降至544 μg ／ mL，STD 為9.23%；21 d 時多糖含量為478 μg ／ mL，STD 為18.29%。表明候選參考品于2 ～8 ℃存放8周、25 ℃存放14 d、37 ℃存放3 d，穩(wěn)定性均良好。反復凍融3 次，穩(wěn)定性良好。見圖2。

圖2 穩(wěn)定性試驗結果Fig.2 Result of stability test

3 討 論

全球第一個23 價肺炎球菌多糖疫苗于1983 年在美國批準上市［9］。2005 年，成都生物制品研究所成功研制了我國首個23 價肺炎球菌多糖疫苗［10］。莢膜多糖作為23 價肺炎球菌多糖疫苗的唯一活性成分，檢測各型多糖含量是效力試驗的替代指標，也是保證疫苗質量穩(wěn)定有效的一項重要指標。1983年，LEE 等［11］建立了光散射定量比濁法檢測各型多糖含量，目前各型多糖含量檢測普遍采用速率比濁法，但缺乏國際標準品，目前我國市場上有4 家企業(yè)生產的23 價肺炎球菌多糖疫苗，均采用企業(yè)自制參考品。

本研究采用由Merck Sharp&Dohme Corp.，U.S.A惠贈的企業(yè)自制參考品（PN-PV-01Mar2016）作為標準品，標定19A 型肺炎球菌多糖候選參考品（成都生物制品研究所有限責任公司生產）。根據(jù)《中國藥典》三部（2020 版）各論對候選參考品進行質量分析，包括蛋白質、核酸、磷、總氮、氨基己糖、甲基戊糖、分子大小以及細菌內毒素含量，結果均符合《中國藥典》三部（2020 版）標準以及國家藥品標準，核磁共振結果顯示，此候選品為19A 型肺炎球菌多糖。多糖含量協(xié)作標定結果顯示，速率比濁法檢測多糖含量重復性好，6 個獨立數(shù)據(jù)的多糖含量RSD均小于10%，內部質控品的19A 型多糖含量RSD 也均小于15%。分裝均勻性評估結果顯示，隨機抽取的50 瓶候選品19A 型多糖含量的RSD 為3.16%，表明分裝均勻性良好。穩(wěn)定性評估結果顯示，2 ～8 ℃存放8 周，25 ℃存放14 d，37 ℃存放3 d，以及反復凍融3 次，穩(wěn)定性均良好。

綜上所述，本實驗成功制備了19A 型肺炎球菌多糖國家參考品，并通過協(xié)作標定確定了多糖含量，可用于肺炎球菌多糖疫苗中的多糖含量檢測。