王雯婧 陳虹帆 邵國峻 廖 虹 趙建立* 李慶軍

（1. 云南大學云南省植物繁殖適應(yīng)與進化生態(tài)學重點實驗室，昆明 650500；2. 云南大學生態(tài)與環(huán)境學院生態(tài)學與進化生物學實驗室，昆明 650500）

花蜜作為被子植物向傳粉者（如蜜蜂）提供的重要報酬，由蜜腺經(jīng)過復雜而有序的生化過程合成，是植物與昆蟲之間建立互惠關(guān)系的關(guān)鍵驅(qū)動力。研究表明，花蜜的成分、分泌量、分泌時間主要受基因調(diào)控，具有物種和/或器官/組織特異性，并與傳粉者的種類、拜訪時間及拜訪行為相對應(yīng)。從進化的角度來看，花蜜在植物生殖策略中起著重要作用，其分泌的相似性與差異性是植物適應(yīng)傳粉者偏好的結(jié)果，植物以此獲得最高的傳粉效率、加強自身的繁殖能力和種群穩(wěn)定性。因此，作為花蜜合成與分泌源頭的蜜腺，對有花植物具有重要的生態(tài)價值，在植物生態(tài)適應(yīng)及多樣化方面發(fā)揮著重要作用。

蜜腺，大多由一層特化的表皮細胞、多層特化的薄壁組織及維管束構(gòu)成，與植物的木質(zhì)部和韌皮部直接關(guān)聯(lián)，體積較小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡單。不同于花內(nèi)主要器官（萼片、花瓣、雄蕊和心皮）沿著花托相對高度保守的排列順序，蜜腺可在花托的任何位置或與任何花器官相聯(lián)系的位置平齊、凸起、內(nèi)藏分布。例如，在毛茛科（Ranunculace?ae）植物耬斗菜（）中，蜜腺位于花距頂端的內(nèi)表面；茄科（Solanaceae）植物矮牽牛（）的蜜腺呈環(huán)狀，圍繞子房基部；豆科（Leguminosae）植物刺槐（）的蜜腺位于雄蕊與子房之間的花托上。在著生位置、形狀、數(shù)量、顏色等方面高度多樣的蜜腺，一定程度上反映了植物類群進化趨勢的多樣化。因此，對蜜腺結(jié)構(gòu)特征的研究，有助于理解相應(yīng)類群的進化規(guī)律及其繁殖特性、探討植物與傳粉動物間的協(xié)同進化關(guān)系，從而深入理解生物多樣性的起源與維持機制。

象牙參屬（）為多年生雌雄同株草本植物，是姜科（Zingiberaceae）中唯一能分布于高山寒溫帶氣候的類群。該屬植物已知約有20 種，為喜馬拉雅山脈和我國西南地區(qū)所特有，通常分布于海拔1 200～4 850 m 的生境中。針對象牙參屬植物開展的傳粉生物學研究，為理解喜馬拉雅山脈和我國西南地區(qū)植物多樣性的起源與維持提供了重要案例。例如，分布于喜馬拉雅山脈的紫花象牙參（）與長喙傳粉昆蟲之間形成協(xié)同演化關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，加深了人們對動植物互作在物種局域適應(yīng)方面的認識。西南地區(qū)的象牙參屬植物在缺乏有效傳粉者的情況下進化出了多樣的繁殖特性，如大花象牙參（）和早花象牙參（）依靠蜜蜂傳粉，長柄象牙參（）具有延遲自交的特性，無柄象牙參（）呈現(xiàn)出主動自交的能力?；谀壳耙延械难芯亢捅狙芯康囊巴庥^測發(fā)現(xiàn)，除無柄象牙參外，其余象牙參屬物種均能產(chǎn)生花蜜。在長期缺少有效傳粉者的情況下，無柄象牙參為繁衍后代，進化出了通過彎曲柱頭接觸花粉的方式實現(xiàn)主動自交。雖然目前象牙參屬植物傳粉生物學方面的研究均涉及花蜜的測定，但缺乏對蜜腺的深入了解，而解析象牙參屬中具有不同繁殖特性物種間蜜腺結(jié)構(gòu)的差異是深入理解該屬植物在高海拔環(huán)境中繁殖與進化適應(yīng)的重要一環(huán)，同時也可為理解高山地區(qū)植物繁殖多樣性的形成提供理論依據(jù)。

本研究以異交物種早花象牙參和主動自交物種無柄象牙參為材料，通過比較解剖學的方法結(jié)合早花象牙參花蜜量和糖分濃度的測定，以回答如下2 個科學問題：（1）2 個物種的蜜腺結(jié)構(gòu)存在怎樣的差異？（2）從形態(tài)學角度來看，無柄象牙參蜜腺不分泌花蜜的原因是什么？

1 材料與方法

1.1 試驗材料

早花象牙參花期在5—6 月，花深紫紅色或黃色，花冠管纖細且較短，花葶明顯伸出葉鞘之上（見圖1A），花柱線形無毛，柱頭黃白色具睫毛（見圖1B）。2019年5月下旬于云南省麗江市麗江高山植物園哈冷古水庫附近（27°3′N，100°11′E）的自然居群，采集當日開花的早花象牙參植株的蜜腺。無柄象牙參花期在7—8 月，花紫紅色或深紫色，花葶較短且隱藏于葉鞘內(nèi)或為突出的短梗（見圖1C），花柱白色或紫色線形，柱頭具睫毛擴大為漏斗狀并彎曲成鉤狀（見圖1D）。2019年7月上旬于云南省麗江市甘海子（27°3′N，100°14′E）的自然居群，采集當日開花的無柄象牙參植株的蜜腺。

圖1 早花象牙參和無柄象牙參花部形態(tài)A.早花象牙參野外生境下的植株；B.早花象牙參具睫毛成漏斗狀的柱頭；C.無柄象牙參野外生境下的植株；D.無柄象牙參朝花粉囊方向勾狀彎曲的柱頭Fig.1 Flower morphology of R.cautleoides and R.schneideriana A.Flowers of R. cautleoides；B.Funneled stigma of R. cautleoides with eyelashes；C.Flowers of R. schneideriana；D.The hooklike stigma of R. sch?neideriana bent to the direction of anthers

固綠FCF、藏花紅T（堿性紅2）購自上海麥克林生化科技有限公司（上海），石蠟購自Leica Bio?systems Richmond，Inc（美國），中性樹膠購自北京索萊寶科技有限公司（北京），甲醛溶液（分析純）購自成都金山化學試劑有限公司（成都），二甲苯（分析純）購自天津市風船化學試劑科技有限公司（天津），無水乙醇（分析純）購自廣東光華科技股份有限公司（汕頭），冰醋酸（分析純）購自廣東省化學試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心（汕頭），粘附載玻片、顯微鏡蓋玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司（海門）。實驗儀器包括：Smartzoom 5 超景深宏觀數(shù)碼顯微鏡購自卡爾蔡司顯微鏡有限公司（德國），石蠟包埋機、輪轉(zhuǎn)式切片機、Leica Micro?systems CMS GmbH、游標卡尺購自徠卡顯微系統(tǒng)有限公司（上海），PXS-A 解剖鏡購自上海普丹光學儀器有限公司（上海），手動移液槍購自德國艾本德股份公司（上海），ATAGO 手持糖度儀（日本），電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海齊欣科學儀器有限公司（上海）等。

1.2 試驗方法

取新鮮象牙參植株的蜜腺，在超景深顯微鏡下進行拍照觀察。

為了解早花象牙參和無柄象牙參蜜腺的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，本研究對二者的蜜腺進行了石蠟切片觀察。用體積分數(shù)50%乙醇配制的FAA溶液固定并保存材料，然后經(jīng)50%、70%、85%、95%、100%系列濃度梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明后用石蠟包埋。包埋的蠟塊經(jīng)過修塊后使用萊卡RM2245 半自動切片機連續(xù)切片（厚度為8～10 μm），1%番紅—固綠染色，封片后，用萊卡生物顯微鏡拍照。

在實驗樣地中隨機選取前1 d 標記、套袋的100 株當日開花個體，依次去除葉片、苞片、萼片、花冠管后將蜜腺暴露出來，隨后利用游標卡尺測量蜜腺長度，通過檢驗進行差異顯著性分析。

在晴天的下午進行早花象牙參花蜜體積及糖分濃度的測定。當日16：00—17：00 隨機選取150株、每株保留1朵即將開放的花苞進行標記、套袋，以確保測量對象均為當日開花的個體，同時排除其他因素（例如：傳粉者拜訪植株吸取花蜜等）的干擾。次日下午（間隔約24 h），依次取下每朵花的套袋，剝離苞片、萼片后，沿花冠管中部將花分為2 個部分，利用0.1～2.5 μL 量程的移液槍吸取花蜜估讀蜜量，同時將吸取的花蜜收集于1.5 mL 離心管中。待150株測量完成后，將收集的花蜜置于手持糖度儀中讀取糖濃度。最后，通過計算平均值獲得單花花蜜的分泌量及糖分濃度。

2 結(jié)果

2.1 花蜜的分泌

在開花期內(nèi)（約8 d），早花象牙參花冠管中有大量無色透明的花蜜，其花蜜分泌持續(xù)整個花周期。結(jié)果顯示，當日開花的早花象牙參單花的花蜜分泌量平均約為1.3 μL，最多可達到4.1 μL（見圖2）。在野外環(huán)境中19.4 ℃條件下，利用手持糖度儀測定收集于離心管中全部花蜜的糖濃度，約為20%。與此相比，無柄象牙參蜜腺表面、花冠管基部及花冠管內(nèi)均未見花蜜（見圖2）。

2.2 蜜腺的外觀形態(tài)

象牙參屬植物的蜜腺體積較小，位于子房上部，包裹于花冠管內(nèi)，具有平坦的外觀，其表面與子房不同，無表皮毛（見圖3：A～B）。超景深顯微鏡觀察及野外測量數(shù)據(jù)顯示：早花象牙參蜜腺呈2條明亮的黃色圓柱體，排列緊密，二者等長或一條稍長（見圖3C），平均約為4.16 mm（標準差：1.00，見圖2）。無柄象牙參蜜腺成2 條短棒狀，其尖端扁平成淡綠色，基部格紋明顯成白色，2 條蜜腺縮短變粗（見圖3D），長度約為2.69 mm（標準差：0.81，見圖2）。早花象牙參的蜜腺顯著長于無柄象牙參（<0.001，見圖3）。概括來看，早花象牙參與無柄象牙參的蜜腺在大小、顏色、形狀方面出現(xiàn)明顯差異。

圖2 早花象牙參與無柄象牙參蜜腺長度及花蜜量的比較Fig.2 Comparisons of nectary length and nectary volume between R.cautleoides and R.schneideriana

圖3 早花象牙參與無柄象牙參蜜腺的外部形態(tài)A、C.早花象牙參蜜腺的位置及形態(tài)；B、D.無柄象牙參蜜腺的位置及形態(tài)Fig.3 Morphology of nectaries in R.cautleoides and R.schneideriana A，C.The position and morphology of nectaries in R.cautleoides；B，D.The position and morphology of nectaries in R.schneideriana

2.3 蜜腺的內(nèi)部結(jié)構(gòu)

從縱切面來看，早花象牙參的蜜腺由分泌表皮和其下的泌蜜組織構(gòu)成。分泌表皮由1 層排列緊密同時又保留一定空隙的細胞組成，表面無明顯凸起或凹陷，淀粉粒沉積且細胞質(zhì)濃厚；泌蜜組織較發(fā)達，由10～13 層多邊形薄壁細胞組成，呈現(xiàn)出明顯的細胞形態(tài)分化及分布區(qū)域特化；輸導組織位于蜜腺中央，包裹于薄壁細胞內(nèi)，與表皮細胞形態(tài)特征相似，成帶狀或片狀連接（見圖4：A～B）。從橫切面來看，表皮細胞內(nèi)有淀粉粒出現(xiàn)；下方薄壁組織具有大液泡及成束分布的維管組織；淀粉粒散布于中央致密分布的韌皮部（見圖4C）。

無柄象牙參蜜腺的分泌表皮細胞排列緊密且無胞間間隙，體積增大、細胞壁清晰，未見明顯淀粉粒且細胞質(zhì)濃度較低；中央輸導組織出現(xiàn)木質(zhì)化的導管（見圖4：D～E）。橫切面可見，其表皮細胞與花柱的細胞形態(tài)相似，泌蜜組織內(nèi)有較多大液泡（見圖4F）。

3 討論

3.1 蜜腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)

姜科植物的蜜腺通常為2枚，位于子房頂部且形狀各異，例如：山姜屬馬來良姜（）的蜜腺為近球狀；山柰屬海南三七（）的蜜腺呈細長線形。與其他姜科植物一樣，早花象牙參與無柄象牙參的花蜜腺也有2枚，近圓柱狀，為結(jié)構(gòu)蜜腺，包裹于花冠管內(nèi)基部、子房上部，由分泌表皮、泌蜜組織及維管組織構(gòu)成。無柄象牙參的蜜腺顯示出一定程度的退化，顯著短于早花象牙參。從早花象牙參蜜腺石蠟切片，可清楚地看出其薄壁組織與維管組織中2種不同細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分布位置的差異（見圖4：A～C）。而無柄象牙參雖保留薄壁細胞和維管組織形態(tài)、分布的分化（見圖4：E～F），但分泌表皮進一步薄壁化。

早花象牙參與無柄象牙參表皮細胞的最大區(qū)別在于：早花象牙參表皮細胞間有空隙、細胞質(zhì)濃厚、淀粉粒儲存較多（見圖4B），而無柄象牙參蜜腺表皮細胞排列緊密、細胞質(zhì)薄、淀粉粒儲存較少甚至無，其形態(tài)更趨向于薄壁細胞（見圖4：E～F）。相關(guān)研究表明，花蜜的分泌取決于蜜腺組織結(jié)構(gòu)及其發(fā)達程度，主要分為2 種途徑：一種是韌皮部運輸?shù)奶妓衔镆缘矸哿Ｐ问絻Υ婊蛑苯舆\送到泌蜜組織，在開花前經(jīng)泌蜜組織加工后分泌出蜜腺外；另一種是蜜腺通過本身所含葉綠體合成碳水化合物并以淀粉粒形式儲存，經(jīng)水解加工后分泌。無論哪一種途徑，均要經(jīng)過淀粉的形成及水解過程。與此同時，花蜜在進入花冠管時均要通過表皮細胞。早花象牙參表皮細胞間的空隙可為泌蜜提供通道，而無柄象牙參蜜腺雖保留了部分輸送淀粉的能力，但表皮細胞可能失去花蜜的泌出或是（同時）水解淀粉的功能。

圖4 早花象牙參與無柄象牙參蜜腺石蠟切片A～C.早花象牙參蜜腺；D～F.無柄象牙參蜜腺；A、D.放大40倍的縱向切片；B、E.放大200倍的縱向切片；C、F.橫切面放大100倍；黃色三角所指為蜜腺，黃色箭頭所指為維管組織，黑色箭頭所指為分泌表皮細胞間隙，紫色三角所指為花柱結(jié)構(gòu)Fig.4 R.cautleoides and R.schneideriana’s paraffin section of nectary A?C.Nectary of R. cautleoides；D?F.Nectary of R. schneideriana；A，D.Longitudinal section microscope magnified by 40 times；B，E.Longitudinal section microscope magnified by 200 times；C，F(xiàn).Horizontal section and magnified 100 times；Yellow triangle indicates nectary，yellow arrow indi?cates vascular tissue，and black arrow indicates secretory epidermal intercellular space，purple triangle indicates the style structure

基于以上結(jié)構(gòu)差異推測，無柄象牙參蜜腺的內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的退化，這可能導致相關(guān)區(qū)域功能缺失，使蜜腺無法實現(xiàn)分泌花蜜的功能。

3.2 蜜腺退化與主動自交的形成

被子植物中約有20%的物種表現(xiàn)出以自交為主要繁殖策略的特性，在授粉者缺乏或花粉傳遞效率低的選擇壓力下，植物通過主動自交實現(xiàn)繁殖。自交的生態(tài)效益和成本取決于自交發(fā)生的方式、時間及其生態(tài)環(huán)境。象牙參屬植物具有較長的花冠管，較艷的花展示，具備長喙昆蟲傳粉綜合征。喜馬拉雅山脈地區(qū)紫花象牙參與長喙傳粉昆蟲之間協(xié)同演化關(guān)系的形成，充分體現(xiàn)了該類長喙昆蟲傳粉綜合征的獨特作用。即使喜馬拉雅山脈的其他象牙參屬物種沒有長喙昆蟲的拜訪，但該屬植物仍可將花蜜作為熊蜂（）訪花的報酬實現(xiàn)完全異交繁殖，如圖杰象牙參（）和耳葉象牙參（）；也可以在有花蜜的情況下通過主動自交實現(xiàn)繁。已有研究報道，分布于橫斷山地區(qū)的象牙參屬植物，包括大花象牙參、早花象牙參和長柄象牙參能分泌花蜜。并且，基于本研究野外的觀察發(fā)現(xiàn)，蒼白象牙參（）、藏象牙參（）、先花象牙參（）、大理象牙參（）、蒼山象牙參（）和昆明象牙參（）均沒有發(fā)現(xiàn)有效的長喙傳粉昆蟲為它們傳粉，但這些物種均能分泌花蜜。此外，除無柄象牙參外，高山象牙參（）、長柄象牙參、藏象牙參均能通過自交實現(xiàn)繁殖，但這些物種的雌蕊并不會發(fā)生彎曲，而是通過花粉接觸柱頭實現(xiàn)主動自交，同時它們的蜜腺也保留了泌蜜能力，能為傳粉者提供報酬。換言之，除無柄象牙參外，其余的象牙參屬植物都具有泌蜜功能。由此我們推測，具有完整蜜腺且能分泌花蜜是象牙參屬植物的原始特征，而無柄象牙參蜜腺的退化是在無傳粉者的情況下，經(jīng)過長期自然選擇的結(jié)果。

在野外調(diào)查中我們發(fā)現(xiàn)，無柄象牙參主要分布于開闊較為干旱的林緣，花期與當?shù)赜昙靖叻迤谥丿B，這可能是導致有效傳粉者缺乏的原因之一。在開花過程中，其柱頭主動向花粉囊彎曲完成自花授粉，付出較小代價的同時獲得了巨大的繁殖保障。由于花蜜中含有大量的糖分、氨基酸及其他物質(zhì)，其分泌過程需要消耗植物約37%的能量。在長期缺乏有效傳粉者的情況下，無柄象牙參在進化過程中可能為了減少無效的繁殖投入，在自交確保繁殖成功的情況下使蜜腺退化、泌蜜功能丟失。

綜合來看，本研究初步探究了象牙參屬植物蜜腺的類型和結(jié)構(gòu)，對比分析了早花象牙參與無柄象牙參蜜腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的異同，為理解象牙參屬植物泌蜜的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)提供了較為直接的證據(jù)，也為理解象牙參屬植物繁殖多樣性的形成提供了形態(tài)學證據(jù)。雖然本研究僅比較了不同繁殖特性物種間成熟蜜腺的形態(tài)差異，但該研究引出了有關(guān)象牙參屬植物蜜腺更深層次的問題，比如這2種象牙參屬植物的蜜腺在發(fā)育過程中是否存在差異？導致這些差異的分子基礎(chǔ)是什么？這些問題的解決，可為理解象牙參屬植物繁殖多樣性的起源與進化適應(yīng)機制提供更深入的證據(jù)。

致謝 衷心感謝中國科學院昆明植物所麗江高山植物園在材料采集和野外觀察試驗上提供的幫助。