黃敏敏，陳美珍，陳 堅(jiān)，鄭偉文*

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所 / 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003； 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 福建 福州 350003)

水生植物滿江紅(Azolla，俗稱紅萍)是蕨類和固氮藍(lán)藻(Nostoc azollae)的共生體，廣泛分布于熱帶和亞熱帶的淡水生態(tài)系統(tǒng)[1—2]。二十世紀(jì)七十年代能源危機(jī)期間，為減少對(duì)化石能源的依賴，我國和東南亞曾一度掀起利用滿江紅作為稻田綠肥和畜禽飼料的熱潮。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)滿江紅體內(nèi)除共生藍(lán)藻外，還有多種細(xì)菌[3—5]。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，滿江紅作為共生固氮的模式植物也日益受到關(guān)注，固氮藍(lán)藻及其宿主滿江紅的基因組全序列測定也先后完成[6—7]。2019年，陳堅(jiān)等[8]通過高通量測序，發(fā)現(xiàn)小葉滿江紅(Azolla microphylla)體內(nèi)含有多種可產(chǎn)生抗菌、抗腫瘤、富集重金屬等活性物質(zhì)的真菌。這意味著，挖掘繁殖快速且取材容易的滿江紅體內(nèi)的真菌資源有可能開發(fā)出有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)品。通過體外培養(yǎng)，進(jìn)一步鑒定滿江紅體內(nèi)真菌的遺傳背景及其潛在功能，成為開發(fā)滿江紅體內(nèi)獨(dú)具特色的真菌資源的重要前提。真菌活性物質(zhì)一般通過發(fā)酵過程取得，作為發(fā)酵懸浮液重要組分的分生孢子其發(fā)育狀態(tài)直接關(guān)系到代謝產(chǎn)物的品質(zhì)與得率。本研究通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)取得一種真菌的純培養(yǎng)物，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，并用電子顯微鏡揭示其分生孢子發(fā)育和衰亡進(jìn)程的結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步驗(yàn)證滿江紅內(nèi)生真菌的遺傳背景及其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌材料

材料為小葉滿江紅(Azolla microphylla)，1982年從國際水稻研究所(International Rice Research Institute)引進(jìn)，編號(hào)為IRRI 4018。為了排除外源真菌等微生物的干擾，參照白克智等[9—10]的莖尖培養(yǎng)法，取得表面無菌的滿江紅純培養(yǎng)物，在IRRI培育基正常繁殖多代。

1.1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基為沙氏(Sabouraud’s)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，麥芽糖 40 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.0。

1.2 內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)

取健康的萍體20 g研磨成勻漿，用接種環(huán)挑取勻漿在沙氏培養(yǎng)基平板上劃線，以上操作均在蘇凈SW-CJ-2F型潔凈工作臺(tái)無菌條件下完成。25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。待菌落長出后，挑取單菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)，直至長成致密的絨毛狀暗藍(lán)綠色菌落。

1.3 內(nèi)生真菌培養(yǎng)物分子鑒定

用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取兩株培養(yǎng)物總 DNA，序列擴(kuò)增用通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR 反應(yīng)體系：ITS1 (10 μmol·L–1)、ITS4 (10 μmol·L–1)及 DNA模板各 1 μL，Taq Plus DNA Polymerase(5 U·μL–1)，dNTP (each 10 m mol·L–1)和 10 X PCR Buffer 共12.5 μL，加無菌雙蒸水 9.5 μL，整個(gè)反應(yīng)體系共25 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物使用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工用 3730XL測序儀進(jìn)行一代雙末端測序，獲得 abi測序峰圖文件，通過軟件組裝后，與NT庫進(jìn)行比對(duì)，獲得近源物種信息。

1.4 掃描電鏡樣品制備與觀察

切取上述真菌培養(yǎng)物用 2.5%戊二醛溶液(0.1 mol·L–1磷酸緩沖液，pH 7.2)在室溫下固定 4 h，用相同磷酸緩沖液洗滌3次后，用2%鋨酸在4 ℃下固定2 h，又經(jīng)磷酸緩沖液充分洗滌后，用乙醇逐級(jí)脫水，并經(jīng)環(huán)氧丙烷替換兩次。試樣用Hitachi HCP-2型臨界點(diǎn)干燥器干燥，經(jīng)干燥的樣品粘附于銅臺(tái)上，在高倍解剖鏡下用細(xì)針將菌落中部分菌絲體剝離，減少菌絲遮蓋，使孢子梗得以充分暴露，再用EIKO IB-5型離子濺射儀噴鍍金鈀。用JEOL JSM-6380lV型掃描電子顯微鏡觀察并拍片。加速電壓15 kV。

1.5 透射電鏡樣品制備與觀察

將上述經(jīng)環(huán)氧丙烷置換的部分樣品包埋于Epon-812環(huán)氧樹脂，后用Leica EM UC7型切片機(jī)切成0.05 μm薄片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色；用Hitachi HT7700型透射電鏡觀察并拍片。加速電壓80 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌體外培養(yǎng)與鑒定

經(jīng)培養(yǎng)純化，共取得2株純培養(yǎng)的真菌，7 d直徑約20 mm，12 d直徑約35 mm，質(zhì)地為絨毛狀至致密；顏色呈灰藍(lán)色至暗藍(lán)色，初期稍淡，老后漸深，近于暗藍(lán)灰綠色(圖 1A)。2株內(nèi)生真菌的體外培養(yǎng)物ITS-PCR產(chǎn)物分子量約600 bp (圖1B)。

圖1 內(nèi)生真菌分離物的菌落形態(tài)及其培養(yǎng)物ITS-PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 1 Colony morphology and Profile of ITS-PCR products of the endo-fungal isolates

用 3730XL測序儀進(jìn)行一代雙末端測序，通過軟件組裝后，獲得如下545 bp的ITS序列：

CCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTGCGGG CTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGA ATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAGCTCC CTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACT TCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAA TATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATC TCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCG AACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA GTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGC CCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGA GCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGT GTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCC CGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCT CGAGCGTATGGGGCTTTATCACCCGCTCGACTA GGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAAC CATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAG GGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA

經(jīng)NT庫比對(duì)，兩株真菌分離物與100株曲霉屬(Aspergillus)真菌的相似度達(dá)99.45%以上，其中58株為聚多曲霉(Aspergillus sydowii)。相似度達(dá)100%的聚多曲霉有30株，為此推測兩株分離物均為子囊菌門(Ascomycota)聚多曲霉(Aspergillus sydowii)(表1)。將測得的ITS與多株具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性的聚多曲霉菌株的 ITS序列在GenBank進(jìn)行比對(duì)(Blastn)，相似度均在98%以上(表 1)[11—15]。

表1 滿江紅內(nèi)生真菌分離物ITS序列比對(duì)結(jié)果Table 1 Comparison of ITS sequence of the endofungal isolates from Azolla

2.2 內(nèi)生真菌分離物分生孢子形態(tài)發(fā)生

該內(nèi)生真菌分離物分生孢子的發(fā)育模式為雙層方式：從菌絲頂端膨大，形成喇叭形頂囊(高3.4 μm × 直徑 5.7 μm)(圖 2A)，由此長出分生孢子梗，包括?；?4.2～5.6 μm × 2.2～3.3 μm)和瓶梗(3.8～5.2 μm × 2.4～3.6 μm) (圖 2B)；隨后從輻射狀的分生孢子梗頂端長出成串圓球形(或橢球形)的分生孢子鏈，數(shù)量可達(dá)數(shù)十至數(shù)千之多，分生孢子直徑2～3.5 μm，表面粗糙，多有細(xì)小的突起(圖 2C)。

圖2 內(nèi)生真菌分離物分生孢子形態(tài)發(fā)生Fig. 2 Conidial morphgenesis of the endo-fungal isolates

2.3 內(nèi)生真菌分離物分生孢子發(fā)育和衰亡進(jìn)程的超微結(jié)構(gòu)

目前對(duì)于分生孢子的發(fā)育階段(即未成熟或成熟)及至衰老死亡在細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平上尚無明確的定義。以下所稱的成熟、健康的分生孢子是指：(1)細(xì)胞膜系(細(xì)胞壁和質(zhì)膜)完整或無明顯內(nèi)陷、斷裂；(2)細(xì)胞器如線粒體、高爾基體和溶酶體等完整、內(nèi)膜無缺損；(3)細(xì)胞電子密度較高，有豐富的核糖體，以及微絲、微管或小泡囊等。不健康的分生孢子指細(xì)胞電子密度低、細(xì)胞器或細(xì)胞膜系統(tǒng)殘缺或扭曲變形。未成熟的分生孢子指細(xì)胞電子密度較高，細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚未分化或尚在分化。后成熟期的分生孢子指雖有細(xì)胞結(jié)構(gòu)但電子密度很低。

圖3A為一正脫離其母體(瓶梗)的分生孢子斜切面觀，該瓶梗的頂部膨大，預(yù)示另一個(gè)分生孢子也將被釋放出。圖3B是圖3A右上角方框的放大圖，這一發(fā)育初期的分生孢子其組成物質(zhì)來自母體，電子密度高說明代謝旺盛，但尚無細(xì)胞器和膜系統(tǒng)等結(jié)構(gòu)分化。圖3C為發(fā)育中期的分生孢子，胞內(nèi)已有線粒體和高爾基體的分化(圖3D)，并有多個(gè)具雙層單位膜的囊泡(直徑40～550 nm)和多條微管，尚未形成完整的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。圖3E是兩個(gè)正在成熟的分生孢子，它們具有真核生物典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和液泡以及核糖體等細(xì)胞器。

圖3 內(nèi)生真菌分離物不同發(fā)育期分生孢子的超微結(jié)構(gòu)Fig. 3 Ultrastructure of the conidia of the endofungal isolate at different developmental stages

圖 4A為一后成熟期的分生孢子，其細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞器基本完整，但電子密度低，并有局部缺損，屬于不健康的細(xì)胞。圖4B的分生孢子細(xì)胞壁基本完整但明顯變形，質(zhì)膜和細(xì)胞器也嚴(yán)重缺損，趨向液泡化。圖4C則是一分生孢子殘?bào)w，細(xì)胞壁、質(zhì)膜消失，除脂滴外，細(xì)胞器多已裂解。這些屬于不健康的分生孢子。

圖4 不健康的分生孢子結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structure of unhealthy conidia

從培養(yǎng)6 d的培養(yǎng)物中隨機(jī)抽取200個(gè)分生孢子，處于分化早、中期的未成熟分生孢子占28.5%，處于成熟期的分生孢子為63%，不健康的占5%，出現(xiàn)類似自噬特征的占3.5%。檢查6 d培養(yǎng)物中100個(gè)成熟、健康的分生孢子，細(xì)胞器出現(xiàn)頻率最高的是線粒體(54%)、脂滴(38%)和被兩層單位膜包被的泡囊(大小為20～100 nm)。統(tǒng)計(jì)12 d的培養(yǎng)物中200個(gè)分生孢子，3%為早中期分生孢子，55%為成熟分生孢子，不健康的占 11.5%，顯現(xiàn)自噬性死亡特征的占 30.5%。說明約三分之一的分生孢子以自噬的形式死亡。

呈現(xiàn)自噬性死亡特征的分生孢子顯然是不健康的。由于其占比高，為此作為重點(diǎn)，從超微結(jié)構(gòu)水平進(jìn)行較詳細(xì)觀察，并將衰亡進(jìn)程分成如下幾個(gè)階段：(1)自噬啟動(dòng)，由單位膜包裹的圓形液泡/溶酶體內(nèi)有一被吞噬并裂解的線粒體結(jié)構(gòu)和多個(gè)細(xì)小的囊泡(圖 5a)，這種自噬性液泡又稱自噬泡或自噬體(autophagosome)；(2)質(zhì)膜內(nèi)陷，分生孢子質(zhì)膜明顯內(nèi)陷，細(xì)胞壁和質(zhì)膜之間的距離達(dá)其半徑的二分之一，兩者間的電子透明區(qū)域幾乎占據(jù)一半以上的空間，并充滿形狀多樣的泡囊或碎片，自噬泡內(nèi)可見部分質(zhì)膜和胞質(zhì)被包裹并降解(圖5b)；(3)胞質(zhì)裂解，此時(shí)分生孢子質(zhì)膜內(nèi)陷超過半徑的三分之二，盡管質(zhì)膜基本完整，但線粒體、脂滴等細(xì)胞器多被裂解，原來濃密的細(xì)胞質(zhì)和核糖體、微絲等內(nèi)含物消失，電子密度顯著下降，細(xì)胞器多被自噬泡或小囊泡所取代(圖 5c)；(4)質(zhì)膜斷裂，且大部分被降解，胞質(zhì)中線粒體、脂滴、高爾基體以及核糖體等細(xì)胞器、內(nèi)含物已基本消失，多個(gè)自噬泡中多為囊泡或細(xì)胞內(nèi)含物的殘?bào)w，表明該分生孢子已瀕臨死亡(圖5d)；(5)整體解構(gòu)，細(xì)胞高度液泡化，所有細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分已崩潰，大部分內(nèi)含物已消失，僅有少量未被消化的囊泡和膜狀斷片，整個(gè)細(xì)胞的電子密度幾近透明，僅細(xì)胞壁保留原來的形態(tài)(圖5e)。

圖5 分生孢子自噬性死亡的結(jié)構(gòu)特征Fig. 5 Structural characteristics of the autophagic death of the conidia

3 討論與結(jié)論

長期以來，水生植物滿江紅被認(rèn)定為蕨類與固氮藍(lán)藻的共生體，而今隨著越來越多的內(nèi)生細(xì)菌被分離培養(yǎng)，人們將滿江紅與微生物的共生關(guān)系上升為蕨-藻-細(xì)菌的三聯(lián)共生[16]。陳堅(jiān)等[8]通過高通量測序，發(fā)現(xiàn)滿江紅體內(nèi)還有真菌存在，將滿江紅與微生物共生關(guān)系的研究又推進(jìn)一步。本研究不僅證實(shí)滿江紅體內(nèi)存在內(nèi)生真菌，還首次實(shí)現(xiàn)滿江紅體內(nèi)真菌的體外培養(yǎng)，用轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1 (ITS1)和間隔區(qū)4 (ITS4)引物通過PCR擴(kuò)增、測序和軟件組裝，取得545 bp序列，經(jīng)Blastn比對(duì)，與聚多曲霉的相似度到99.45%的菌株在100株以上，從分子水平上明確了該內(nèi)生真菌分離物的分類位置。

分生孢子是有隔菌絲霉菌中最常見的一類無性孢子，是大多數(shù)子囊菌門真菌的無性繁殖方式。分生孢子的形態(tài)、構(gòu)造、大小和排列等特征因種而異，是菌種鑒定的重要依據(jù)[16—17]。為此本研究用掃描電鏡對(duì)滿江紅內(nèi)生真菌分生孢子的發(fā)生和發(fā)育模式進(jìn)行觀察。子囊菌門的曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)是兩個(gè)進(jìn)化關(guān)系相當(dāng)接近、均具有分化明顯并產(chǎn)生一定形狀的分生孢子梗的屬，但曲霉的分生孢子梗頂端膨大成頂囊，頂囊上半部著生呈輻射狀排列的小梗，小梗末端形成分生孢子鏈；而青霉的分生孢子梗頂端多次分枝成掃帚狀，分枝頂端著生小梗，小梗上串生分生孢子[18—19]。本研究觀察到喇叭狀的頂囊，上面著生輻射狀的分生孢子鏈，因而可排除屬于青霉的可能性。對(duì)真菌分離物分生孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)育模式的觀察表明，其分生孢子發(fā)生模式為芽殖型(blastic)[16—17]，其分生孢子的形狀、大小等具有曲霉屬真菌的典型特征[18]。這與分子鑒定結(jié)果一致，因而可以進(jìn)一步認(rèn)定該分離物為聚多曲霉，屬子囊菌門(Ascomycota)散囊菌目(Eurotium)發(fā)菌科(Trichocomaceae)。

更有意義的是，將該分離物的ITS序列與能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)的多種聚多曲霉菌株比對(duì)，相似度均大于98%，表明本研究獲得的滿江紅內(nèi)生真菌聚多曲霉具有上述潛能，值得進(jìn)一步研究，以確定其應(yīng)用價(jià)值。

本研究還對(duì)不同發(fā)育期的分生孢子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行定義和比較分析。結(jié)果表明，分離的聚多曲霉在沙氏平板培養(yǎng)6 d與12 d，其分生孢子發(fā)生與老化程度有如下區(qū)別：6 d培養(yǎng)物處于發(fā)育早中期的分生孢子比12 d培養(yǎng)物高約25%，成熟的分生孢子也比后者高8%。而12 d培養(yǎng)物不健康或呈現(xiàn)自噬特征的分生孢子比6 d培養(yǎng)物高約35%。出現(xiàn)不健康的分生孢子可能是 DNA復(fù)制出錯(cuò)或翻譯時(shí)蛋白質(zhì)折疊異常所致，在發(fā)育早期或后期均可能發(fā)生；也可能是菌體之間營養(yǎng)競爭導(dǎo)致的死亡。12 d培養(yǎng)物中不健康或衰亡的分生孢子比例偏高可能與自制的平板培養(yǎng)基厚度較薄，營養(yǎng)在短期內(nèi)耗盡有關(guān)，營養(yǎng)元素缺乏作為一種化學(xué)信號(hào)可能誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡；也可能是取樣誤差所致。固體培養(yǎng)基上的真菌菌苔隨著培養(yǎng)時(shí)間的推進(jìn)由中心向外周呈輻射狀生長(圖1A)。在菌齡12 d的菌苔中心處取樣，其分生孢子老化的比例可能大于在菌苔外緣處取樣的分生孢子。后續(xù)將在研究中對(duì)不同取樣區(qū)域的觀察結(jié)果進(jìn)行比較，制定更科學(xué)的取樣標(biāo)準(zhǔn)，以避免因取樣造成誤差。懸浮液是真菌發(fā)酵的主要產(chǎn)物。分生孢子的生育狀況直接關(guān)系到其代謝產(chǎn)物的質(zhì)量與數(shù)量。上述結(jié)果啟示在后續(xù)的開發(fā)研究中應(yīng)通過發(fā)酵條件的優(yōu)化以調(diào)控其生育狀況從而取得最佳的產(chǎn)品得率。

細(xì)胞程序性死亡是真核生物死亡的重要形式，可分為凋亡、自溶和自噬等類型[20]。滿江紅內(nèi)生真菌培養(yǎng)物中不健康分生孢子除了電子密度低、細(xì)胞內(nèi)含物裂解外，其外膜系統(tǒng)尤其細(xì)胞壁有明顯的程序性死亡特征。如圖4B近似于凋亡(apoptosis-like)，細(xì)胞壁呈不規(guī)則的內(nèi)陷變形；而圖4C更接近于自溶(autolysis-like)，即細(xì)胞壁自我溶解；圖5e分生孢子幾乎中空，殘存但形態(tài)完整的細(xì)胞壁則是自噬性死亡區(qū)別于凋亡和自溶的重要標(biāo)志[20]。

自噬是單細(xì)胞或多細(xì)胞真核生物將其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物移入自噬泡(液泡、溶酶體或兩者融合)進(jìn)而自我消化的動(dòng)態(tài)過程。它也是各種生物為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)平衡，達(dá)到新的適應(yīng)水平的自我保護(hù)和調(diào)節(jié)過程[21—22]。自噬性死亡(Autophagic cell death)是細(xì)胞通過自噬而實(shí)現(xiàn)自我“犧牲”的消亡過程，是細(xì)胞程序性死亡的一種重要方式。本研究分生孢子自噬性死亡的幾個(gè)階段與真核生物自噬性死亡的超微結(jié)構(gòu)變化基本吻合[22—23]。圖5a中自噬泡的出現(xiàn)，是典型的自噬，可視為自噬性死亡的早期信號(hào)。但因其胞質(zhì)電子密度較高，也可能是一種自我調(diào)節(jié)的可逆行為。圖5d中溶酶體與液泡的融合是自噬泡形成和擴(kuò)展，最終導(dǎo)致死亡的主要途徑。

本研究首次分離培養(yǎng)，并通過測序比對(duì)和形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，鑒定了水生植物滿江紅的內(nèi)生真菌聚多曲霉的存在，較為系統(tǒng)地揭示了其分生孢子發(fā)育模式以及發(fā)生與衰亡進(jìn)程的結(jié)構(gòu)特征，為聚多曲霉活性物質(zhì)的開發(fā)和利用及其基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供了細(xì)胞學(xué)依據(jù)，并啟示對(duì)水生植物滿江紅內(nèi)生真菌資源的開發(fā)是有意義的課題。