易媛，趙敏惠，左勇,*，馬倩，胡琨，黃慶

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644005)2(四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都，610101)

桑葚作為藥食同源的水果，富含維生素、蛋白質(zhì)、微量元素及多種功能活性物質(zhì)[1]。桑葚功能性雖強(qiáng)，但果品運(yùn)輸、貯藏中耗損大，除鮮食外，少部分被精深加工為果汁、果酒等，產(chǎn)品線單一[2]。酵素作為新興產(chǎn)品，有機(jī)酸、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，且發(fā)酵賦予了產(chǎn)品良好的口感和風(fēng)味，其清潔腸道、解酒護(hù)肝、抗氧化等功效深受消費(fèi)者喜愛[3]。

酵素制作工藝多采用自然發(fā)酵，為混菌發(fā)酵體系，其微生物組成和代謝過程復(fù)雜，品質(zhì)和風(fēng)味優(yōu)于接種發(fā)酵[4]。由于環(huán)境微生物的復(fù)雜性，導(dǎo)致酵素發(fā)酵機(jī)理不明確，產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，不適合現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)。因此，對(duì)酵素自然發(fā)酵過程的理化和功能成分進(jìn)行監(jiān)測和分析，有助于探究酵素的自然發(fā)酵機(jī)理。

本研究以自然發(fā)酵桑葚酵素為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，檢測傳統(tǒng)酵素發(fā)酵過程中主要活性成分的變化，了解酵素功能活性物質(zhì)的代謝規(guī)律，并分析各活性成分對(duì)產(chǎn)品抗氧化性產(chǎn)生的影響，旨在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)桑葚酵素的抗氧化機(jī)制，為改善自然發(fā)酵酵素工藝、減少損耗，及標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)桑葚酵素提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚(購于宜賓農(nóng)貿(mào)市場)；白砂糖，市售一級(jí)；DPPH、ABTS，美國Sigma公司；福林酚、沒食子酸、蘆丁(AR級(jí))，麥克林生化科技有限公司；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、乙酸，HPLC級(jí)，純度≥99%)，上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1260 infinityⅡ高效液相色譜儀，美國Agilent公司；HWS-12恒溫水浴鍋，上海喬欣科學(xué)儀器有限公司；0.22 μm水系濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AR1140電子天平，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酵素的制備

桑葚用無菌水沖洗后，自然晾干，白砂糖用紫外照射45 min，玻璃發(fā)酵罐高壓蒸汽滅菌。將桑葚與糖按質(zhì)量比2∶1的比例混合，放入發(fā)酵罐中，密封后28 ℃避光發(fā)酵80 d。分別于發(fā)酵0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、80 d取樣，1 000 r/min離心10 min后，取上層發(fā)酵液置于-80 ℃冰箱中保存，待測。

1.3.2 桑葚酵素理化指標(biāo)的測定

采用pH計(jì)測定pH值；還原糖含量的測定采用DNS法[5]；總酸含量的測定參照GB 12456-2021《食品中總酸的測定》中的pH計(jì)電位滴定法。

1.3.3 主要抗氧化成分測定

總酚的測定使用福林—酚比色法[6]，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=5.547x+0.002 2(R2=0.999 6) 計(jì)算總酚濃度，以沒食子酸的質(zhì)量計(jì)。總黃酮的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[7]，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001x+0.005 4(R2=0.999 3)計(jì)算總黃酮含量，以蕓香甙的質(zhì)量計(jì)。

1.3.4 體外抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照文獻(xiàn)[8]的方法；·OH清除能力測定參照文獻(xiàn)[9]的方法；ABTS陽離子自由基清除能力測定參照文獻(xiàn)[10]的方法；還原力的測定參照文獻(xiàn)[11]的方法。

1.3.5 有機(jī)酸含量測定

參照楊建飛等[12]的方法并加以改進(jìn)。高效液相色譜條件：Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，流動(dòng)相A為KH2PO4溶液(pH=2.54)，流動(dòng)相B為甲醇溶液，V(KH2PO4)∶V(甲醇)=95∶5，進(jìn)樣量10 μL，VWD檢測器，檢測波長210 nm，流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析及主成分分析，采用SIMCA 14.1對(duì)主成分的分圖進(jìn)行繪制，采用Origin 2018、Excel繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

桑葚酵素發(fā)酵過程中還原糖、pH和總酸的變化如圖1所示。發(fā)酵的前30 d，還原糖總體呈不斷下降的趨勢，從初始的532.71 g/L下降到388.08 g/L。而總酸呈不斷上升的趨勢，從初始的4.55 g/L上升到28.69 g/L，證明發(fā)酵體系中的微生物利用糖生長代謝，并產(chǎn)生以乳酸、乙酸為主的大量有機(jī)酸，同時(shí)使pH從初始的4.58下降至3.16。30 d以后，還原糖、總酸基本趨于平穩(wěn)，表明微生物代謝減弱，發(fā)酵進(jìn)入后熟階段。到發(fā)酵截止的80 d內(nèi)，還原糖含量輕微浮動(dòng)，可能是微生物分解利用桑葚原料中的糖類物質(zhì)引起的[13]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，總酸含量為26.97 g/L，其下降的原因可能是發(fā)酵液中的有機(jī)酸被氧化分解、形成脂類、被菌群作為碳源消耗等。

a-還原糖含量；b-pH、總酸含量圖1 不同發(fā)酵時(shí)間還原糖、pH、總酸含量的變化Fig.1 The change of reducing sugar content, pH and total acid content

2.2 發(fā)酵過程中主要抗氧化成分的變化

桑葚酵素發(fā)酵過程中總酚、總黃酮的測定結(jié)果如圖2所示。在發(fā)酵5 d，總酚和總黃酮急劇上升，可能是由于原料處理時(shí)，加糖攪拌使原料發(fā)生氧化，密封發(fā)酵后，部分多酚物質(zhì)的溶出導(dǎo)致的。5 d后總酚和總黃酮減少的原因可能是酚類化合物與固形物、蛋白質(zhì)甚至酵母結(jié)合或吸附，導(dǎo)致了酚類化合物含量的下降[14]。

圖2 桑葚酵素發(fā)酵過程中總酚、總黃酮含量的變化Fig.2 Changes of total phenol and total flavone contents in mulberry fermentation

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，某些大分子酚類物質(zhì)逐漸被微生物分解為小分子酚類化合物，使總酚和總黃酮濃度不斷增加[15]，在發(fā)酵40 d時(shí)達(dá)到最大值，分別為3.42 g/L和3.60 g/L。40 d后，總酚和總黃酮開始呈下降趨勢，可能是由于發(fā)酵時(shí)間過長，多酚類化合物發(fā)生非酶促反應(yīng)，進(jìn)一步聚合[16]。此結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[17-18]。

2.3 發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化

由圖3-a所示，桑葚酵素DPPH自由基清除能力在發(fā)酵過程中緩慢上升，25 d時(shí)，從初始的64.59%上升至最大值71.16%，之后開始有輕微的上下浮動(dòng)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)DPPH自由基清除能力為69.37%。偉仕靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中總酚的變化與其DPPH自由基清除能力之間有明顯的相關(guān)性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

由圖3-b所示，桑葚酵素ABTS陽離子自由基清除能力25 d內(nèi)從初始的59.31%迅速上升至73.41%，25 d后緩慢上升，于50 d時(shí)達(dá)到最大值74.04%，之后又略有下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的清除能力為70.85%。桑葚酵素發(fā)酵過程中ABTS陽離子自由基清除能力的變化與總酚含量變化相似，HAGERMAN等[20]研究表明酚類化合物的聚合度、共軛度、酚類取代基的數(shù)量和排列以及分子質(zhì)量在清除ABTS陽離子自由基上起著關(guān)鍵作用。

由圖3-c所示，桑葚酵素·OH清除能力在發(fā)酵的前30 d明顯增強(qiáng)，于第30天達(dá)到最大值39.83%，相較初始的·OH清除率19.28%，增長了106.58%。30 d后，桑葚酵素的·OH清除能力略有下降后趨于平穩(wěn)。·OH清除率的變化可能是有機(jī)酸、酚類物質(zhì)、酵母代謝產(chǎn)物綜合作用的結(jié)果[21]。

由圖3-d所示，發(fā)酵過程中桑葚酵素的還原力隨發(fā)酵時(shí)間增加，呈不斷上升然后趨于平穩(wěn)的趨勢，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，桑葚酵素的還原力從初始的0.72上升到0.77。還原力的變化趨勢區(qū)別于其他抗氧化指標(biāo)的原因與其抗氧化機(jī)制相關(guān)。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-·OH清除率;d-還原力圖3 桑葚酵素發(fā)酵過程中體外抗氧化指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of antioxidant indexes in vitro during fermentation of mulberry Jiaosu

2.4 發(fā)酵過程中有機(jī)酸種類和含量的變化

對(duì)桑葚酵素有機(jī)酸含量進(jìn)行測定，由圖4可知，桑葚原料不含丙酮酸，經(jīng)過發(fā)酵后，共檢出8種有機(jī)酸，其中酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的含量較高，最高含量分別達(dá)到11.02、13.77、9.63、4.02、2.57 g/L，而草酸、丙酮酸、蘋果酸含量一直在1.0 g/L以下變化，說明桑葚酵素中的主要有機(jī)酸可能是酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。

乳酸和乙酸是有機(jī)酸中占比最高、變化最大的酸。原料中乳酸和乙酸的含量分別為0.46 g/L和0.77 g/L，在發(fā)酵過程中先增加后減少，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其含量分別為11.10 g/L和7.05 g/L。因?yàn)槿樗峋痛姿峋墙退匕l(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種，發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸，使總酸升高，pH值降低，從而又抑制了乳酸菌和醋酸菌的繁殖[22]。檸檬酸在發(fā)酵過程中沒有明顯的變化規(guī)律，這可能是因?yàn)闄幟仕釁⑴c三羧酸循環(huán)，在發(fā)酵過程中不易累積[23]。酒石酸作為桑葚原料中含量最多的有機(jī)酸，經(jīng)發(fā)酵后，呈先上升后下降的趨勢。酒石酸的增加可能是由于pH值的急劇降低和原料的溶出造成的，然后因氧化降解或沉淀而減少[24]。

圖4 桑葚酵素發(fā)酵過程有機(jī)酸含量的變化Fig.4 Changes of organic acid content in mulberry fermentation process

2.5 發(fā)酵過程中各指標(biāo)與抗氧化的相關(guān)性分析及主成分分析

2.5.1 各指標(biāo)變化與抗氧化性活性的相關(guān)性分析

表1展示了桑葚酵素發(fā)酵過程中各指標(biāo)變化與4種不同抗氧化活性的相關(guān)性，除檸檬酸外，其它成分與4種抗氧化指標(biāo)均呈極顯著的相關(guān)性(P<0.01)。其中pH、還原糖與抗氧化能力呈極顯著的負(fù)相關(guān)，其他活性成分則與抗氧化能力呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)。證明總酚、總黃酮類及有機(jī)酸含量對(duì)桑葚酵素的抗氧化活性有很大影響。

表1 桑葚酵素發(fā)酵過程中各成分與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性Table 1 Correlation between antioxidant indexes and components in mulberry fermentation process

2.5.2 主成分分析

為進(jìn)一步挖掘桑葚酵素活性物質(zhì)與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性，應(yīng)用主成分分析法對(duì)上述指標(biāo)加以分析，得到主成分相關(guān)矩陣的特征值、貢獻(xiàn)率如表2所示，2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為81.464%(>80%)，基本包含大多數(shù)樣本信息。

表2 解釋的總方差Table 2 The total variance explained

主成分分析載荷圖如圖5所示，各指標(biāo)之間相關(guān)性強(qiáng)的變量聚集在一起，距離越近，相關(guān)性越大。第3象限中，蘋果酸、丙酮酸、乙酸、乳酸、總酸與·OH清除能力具有很高的相關(guān)性，且與pH和還原糖呈極顯著的負(fù)相關(guān)。第2象限中，ABTS陽離子自由基清除率與總酚距離最近，說明二者相關(guān)性極顯著，除檸檬酸外，其余成分之間也存在一定的正相關(guān)性，此結(jié)果與上述相關(guān)性分析相似。

圖5 主成分分析載荷圖Fig.5 Principal component analysis loading plot

主成分樣品得分圖如圖6所示。發(fā)酵0 d和5 d離其他位置相對(duì)較遠(yuǎn)，說明這2個(gè)樣品與其它樣品之間差異較大。發(fā)酵10、15 d和20、25、30 d在第2主成分上的差別都不大，但在第1主成分上，發(fā)酵10、15 d得分為正值，20、25、30 d得分為負(fù)值。發(fā)酵40、50、60、80 d主要集中在第2象限，各樣品之間無顯著差異。

圖6 主成分樣品得分圖Fig.6 Scoring plot of principal component samples

基于主成分分析法，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間桑葚酵素構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)指數(shù)體系。以表2的兩個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的方差相對(duì)貢獻(xiàn)率為權(quán)重，得到桑葚酵素綜合評(píng)價(jià)指數(shù) (comprehensive evaluation index, CEI)計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：CEI，綜合評(píng)價(jià)指數(shù)；PC1，第1主成分；PC2，第2主成分。

不同發(fā)酵時(shí)間桑葚酵素樣品的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)如圖7所示，CEI在0～5 d變化不大，可能是在高糖環(huán)境下，微生物處于適應(yīng)期。發(fā)酵5～15 d，CEI迅速上升，發(fā)酵15 d以后，CEI上升緩慢，到30 d時(shí)達(dá)到最大值，為0.90。此后，CEI逐漸下降并趨于平穩(wěn)。參考CEI，可判斷桑葚酵素的發(fā)酵終點(diǎn)為30 d。

圖7 桑葚酵素綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)Fig.7 Comprehensive evaluation index of mulberry Jiaosu

3 結(jié)論

對(duì)桑葚酵素發(fā)酵過程中的功能活性物質(zhì)及體外抗氧化能力變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)總酚和總黃酮呈先上升后下降的趨勢，于40 d時(shí)分別達(dá)到最大值3.42 g/L和3.60 g/L，且多酚類物質(zhì)含量的變化與體外抗氧化能力變化呈顯著的正相關(guān)性；經(jīng)發(fā)酵，桑葚酵素中共檢出8種有機(jī)酸，酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸作為桑葚酵素中的主要有機(jī)酸，含量最高達(dá)到11.02、13.77、9.63、4.02、2.57 g/L，且除檸檬酸外的有機(jī)酸在發(fā)酵過程中的變化均與抗氧化指標(biāo)呈顯著的正相關(guān)，表明這些活性物質(zhì)是影響桑葚酵素抗氧化能力的重要因素。通過對(duì)所有指標(biāo)進(jìn)行綜合性分析，桑葚酵素可分為4個(gè)發(fā)酵階段：發(fā)酵初期(0～5 d)、發(fā)酵中期(5～15 d)、發(fā)酵后期(15～30 d)及后熟期(30～80 d)，CEI于30 d達(dá)到最大值，結(jié)合時(shí)間成本考慮，可將30 d確定為桑葚酵素的發(fā)酵終點(diǎn)。這將為縮短桑葚酵素發(fā)酵周期、提高桑葚酵素抗氧化力提供理論基礎(chǔ)。