張毅，牛德強(qiáng)，嚴(yán)濤，陳珂可，朱建國(guó)，夏九學(xué)*

（1.山東省工業(yè)和信息化研究院，山東 濟(jì)南 250013；2.山東亞奧特乳業(yè)有限公司，山東 泰安 271000；3.微康益生菌（蘇州）股份有限公司，江蘇 蘇州 215200）

乳酸菌作為一種益生菌，可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、細(xì)菌素、胞外多糖、不飽和脂肪酸、B族維生素等[1-3]。其中蛋白質(zhì)類抑菌代謝產(chǎn)物主要為細(xì)菌素，它是由某些乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)過(guò)代謝產(chǎn)生的一類具有抑菌作用的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，具有可抑制腐敗菌和致病菌生長(zhǎng)的能力[4-7]，可廣泛應(yīng)用于乳制品發(fā)酵、泡菜腌制、肉制品加工、乳酸菌飲料生產(chǎn)以及畜牧養(yǎng)殖（如飼料、青貯）等領(lǐng)域[8-12]。目前乳酸菌在發(fā)酵生長(zhǎng)過(guò)程中代謝所產(chǎn)生的細(xì)菌素，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究[13-15]。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是一種發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)芽孢的乳酸菌[16]，是目前國(guó)內(nèi)唯一一個(gè)收錄于食品名單目錄的芽孢桿菌[17]。研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌代謝產(chǎn)物除了乳酸，還有有機(jī)酸（乙酸等）、不飽和脂肪酸等物質(zhì)[16，18]，但是目前對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌物質(zhì)（除有機(jī)酸以外的物質(zhì)）的研究鮮有報(bào)道[19]。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離、篩選及鑒定，得到一株凝結(jié)芽孢桿菌 BC99（Bacillus coagulans BC99），除了具有一般乳酸菌應(yīng)有的益生菌功能性能，還具有抗逆性強(qiáng)（耐酸、耐膽鹽、耐高溫）等芽孢桿菌的特性[17]，彌補(bǔ)了一般乳酸桿菌抗逆性、耐受性的不足。本研究對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99的代謝產(chǎn)物的抑菌性能進(jìn)行初步研究，排除一些酸性代謝物質(zhì)（乳酸、乙酸等）、過(guò)氧化氫等對(duì)抑菌效果的影響，并對(duì)其代謝產(chǎn)物抑菌物質(zhì)進(jìn)行初步的判斷，為后續(xù)的應(yīng)用（如食品、保健食品、畜牧、飼料、水產(chǎn)等）及研究開發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

凝結(jié)芽孢桿菌BC99：微康益生菌（蘇州）股份有限公司，分離篩選自泡菜中；大腸埃希菌（Escherichia coli CVCC 1527）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium CVCC 2228）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CVCC 4098）、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuis CVCC 503）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis CAU 0805）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens CVCC 46）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella CVCC 1676）：中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）固體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶（2 500 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg）、蛋白酶 K（30 U/mg）、過(guò)氧化氫酶（3 000 U/mg）：美國(guó)Sigma公司；鹽酸：西隴科學(xué)股份有限公司；氫氧化鈉、乳酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 主要儀器和設(shè)備

DHP-200恒溫培養(yǎng)箱：金壇市白塔新寶儀器廠；IS-RDD3迥旋式恒溫?fù)u床：廣州市深華生物技術(shù)有限公司；PHS-3E型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SW-CT-2FD雙人超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；GL-12M高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；BAS 124S電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DHG-9246A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Thermo 902超低溫冰箱：美國(guó)Thermo公司；HH-6J數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市友聯(lián)儀器研究所；902型-80℃超低溫冰箱：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.4 菌種活化及培養(yǎng)

從-80℃超低溫冰箱中取出凝結(jié)芽孢桿菌BC99菌株，在PCA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為42℃有氧培養(yǎng)48 h。從長(zhǎng)出菌落的培養(yǎng)皿中挑取單一菌落并無(wú)菌操作接種于PCA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為42℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。指示菌的培養(yǎng)按2%的接種量接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。

1.5 凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品的準(zhǔn)備

將活化后的凝結(jié)芽孢桿菌BC99接種于MRS液體培養(yǎng)基中，42℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99發(fā)酵液進(jìn)行離心，4℃下，6 500 r/min離心15 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜，過(guò)濾液即為代謝產(chǎn)物粗品，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌效果的評(píng)價(jià)方法

抑菌效果的評(píng)價(jià)采用牛津杯法。無(wú)菌生理鹽水分別將指示菌菌液（大腸埃希菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌）梯度稀釋成約1×108CFU/mL的菌懸液備用，待平板中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基凝固后，吸取0.1 mL指示菌溶液于固體平板上，用無(wú)菌涂布棒涂布均勻，待平板表面的指示菌菌液全部涂布均勻并吸收后，在平板培養(yǎng)基表面放置無(wú)菌牛津杯，并在杯中加入凝結(jié)芽孢桿菌BC99的代謝產(chǎn)物粗品0.2 mL，在4℃冰箱中擴(kuò)散培養(yǎng)4 h，將固體培養(yǎng)基在37℃下恒溫有氧培養(yǎng)24 h，測(cè)定其代謝產(chǎn)物粗品的抑菌圈直徑。其中牛津杯內(nèi)徑約為6 mm，每組3個(gè)重復(fù)，用抑菌圈平均直徑來(lái)評(píng)價(jià)抑菌活性大小。

1.7 抑菌物質(zhì)的研究

1.7.1 抑菌譜

采用牛津杯法，以大腸埃希菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、豬霍亂沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、枯草芽孢桿菌、多殺性巴氏桿菌為指示菌，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99進(jìn)行抑菌能力的評(píng)價(jià)試驗(yàn)，其抑菌能力的大小以抑菌圈的直徑來(lái)表示，對(duì)抑菌效果較好的菌株繼續(xù)進(jìn)行抑菌研究。

1.7.2 不同預(yù)處理pH值對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響

用0.5 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)凝結(jié)芽孢桿菌BC99的代謝產(chǎn)物粗品的pH值，pH值梯度為2、4、6、8、10，為避免不同 pH 值對(duì)指示菌的影響，在37℃下處理1 h后再回調(diào)pH值至6，做牛津杯抑菌試驗(yàn)，方法同1.6，采用指示菌進(jìn)行試驗(yàn)，觀察抑菌圈直徑的大小，考察不同pH值預(yù)處理后對(duì)其代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響。

1.7.3 不同溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響

將代謝產(chǎn)物粗品分別在不同溫度梯度（-20、4、37、80、121℃）條件下處理30 min后測(cè)定抑菌能力，做牛津杯抑菌試驗(yàn)，方法同1.6，觀察抑菌圈直徑的大小，考察不同溫度條件對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響。

1.7.4 菌體及殘留細(xì)胞對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99抑菌能力的影響

將凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品用微孔過(guò)濾膜過(guò)濾除菌后，將過(guò)濾液進(jìn)行抑菌能力的試驗(yàn)，與未過(guò)濾的發(fā)酵菌液進(jìn)行抑菌能力的比較，做牛津杯抑菌試驗(yàn)，方法同1.6，觀察抑菌圈直徑的大小，考察凝結(jié)芽孢桿菌BC99的菌體對(duì)抑菌能力的影響。

1.7.5 不同酶對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響

用0.5 mol/L鹽酸和0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和過(guò)氧化氫酶的最適pH值，將凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品與各種酶分別在37℃水浴條件下反應(yīng)30 min后，再調(diào)節(jié)pH值至6，研究不同蛋白酶處理凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品，以未經(jīng)酶處理的凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品為對(duì)照組。做牛津杯抑菌試驗(yàn)，方法同1.6，通過(guò)觀察對(duì)照組和試驗(yàn)組抑菌圈直徑大小，評(píng)價(jià)凝結(jié)芽孢桿菌BC99抑菌代謝物質(zhì)是否為蛋白類物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌譜

凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品對(duì)指示菌的抑制效果見(jiàn)圖1。

圖1 代謝產(chǎn)物粗品抑菌譜Fig.1 Antibacterial spectrum of crude metabolites

由圖1可知，凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均有一定的抑制程度，對(duì)常見(jiàn)的幾種食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等具有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)動(dòng)物源的多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌也有一定的抑制效果，這說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌BC99的代謝產(chǎn)物具有廣譜抗菌效果，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物抗菌物質(zhì)的研究有了更進(jìn)一步研究的必要性。

2.2 不同預(yù)處理pH值對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響

凝結(jié)芽孢桿菌BC99的代謝抑菌產(chǎn)物粗品在不同pH值條件下預(yù)處理1 h后，其對(duì)不同指示菌的抑菌效果如圖2所示。

圖2 不同預(yù)處理pH值對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響Fig.2 Effects of different pretreatment pH on the antibacterial ability of crude metabolites of Bacillus coagulans BC99

由圖2可知，在不同pH值條件預(yù)處理下，凝結(jié)芽孢桿菌BC99菌株的代謝產(chǎn)物粗品對(duì)4種不同指示菌的抑菌圈大小有不同影響。當(dāng)預(yù)處理的pH值從2上升到6時(shí)，其凝結(jié)芽孢桿菌BC99菌株代謝產(chǎn)物粗品的抑菌圈直徑逐漸增加，相應(yīng)的抑菌活性呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH值大于6時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌BC99菌株代謝產(chǎn)物粗品的抑菌圈直徑越來(lái)越小，相對(duì)應(yīng)的抑菌活性逐漸下降。凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品在pH值為6時(shí)，其抑菌產(chǎn)物粗品的抑菌圈直徑最大，抑菌活性也相應(yīng)最大。說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品的抑菌效果最佳的預(yù)處理pH值在6左右?？赡苁穷A(yù)處理pH值過(guò)高或過(guò)低，其環(huán)境中H+的多少會(huì)使代謝產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響了其抑菌效果。

2.3 不同溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響

采用不同溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品進(jìn)行處理，其對(duì)指示菌抑菌效果如圖3所示。

圖3 不同溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響Fig.3 Effects of different temperatures on the antibacterial ability of crude metabolites of Bacillus coagulans BC99

由圖3可知，在37℃條件下處理的凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品具有最高的抑菌活性，說(shuō)明此溫度是凝結(jié)芽孢桿菌BC99最佳的拮抗其它菌株的溫度。當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，代謝產(chǎn)物粗品仍存在較高的抑菌活性，當(dāng)121℃處理30 min時(shí)，其代謝產(chǎn)物粗品的活性大幅下降，說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌BC99抑菌代謝物質(zhì)已大部分失活。凝結(jié)芽孢桿菌BC99處于溫度較低（4℃）或常溫（25℃）條件時(shí)，其代謝產(chǎn)物粗品仍具有一定抑菌能力，其抑菌活性還保持在一個(gè)比較好的水平，說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌BC99抑菌代謝物質(zhì)在冷藏保鮮中可以作為一種生物保鮮劑或食品保鮮劑，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期[20]，在食品方面具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 菌體及殘留細(xì)胞對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99抑菌能力的影響

以凝結(jié)芽孢桿菌BC99培養(yǎng)的發(fā)酵菌液和代謝產(chǎn)物粗品進(jìn)行相應(yīng)的抑菌圈試驗(yàn)，比較其菌體或殘留細(xì)胞對(duì)不同指示菌的抑菌效果，如圖4所示。

圖4 凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品和菌液抑菌能力的對(duì)比Fig.4 Comparison activity between the crude metabolites and bacterial liquids of Bacillus coagulans BC99

由圖4可知，相同體積的過(guò)濾后代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力稍低于含凝結(jié)芽孢桿菌BC99的菌體及殘留細(xì)胞的發(fā)酵菌液。表明凝結(jié)芽孢桿菌BC99對(duì)指示菌的抑制作用主要來(lái)源于其胞外代謝產(chǎn)物。

2.5 不同酶對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響

對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99的代謝產(chǎn)物粗品進(jìn)行不同蛋白酶的處理，對(duì)指示菌的抑制效果如圖5所示。

圖5 不同酶對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品抑菌能力的影響Fig.5 Effects of different enzyme on the antibacterial ability of crude metabolites of Bacillus coagulans BC99

采用各種酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K）對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品進(jìn)行處理后，處理組的抑菌圈直徑明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；而采用過(guò)氧化氫酶處理后，處理組的抑菌活性與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05）。說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K蛋白酶的水解作用較為敏感，而對(duì)過(guò)氧化氫酶的作用效果無(wú)明顯變化。說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌BC99的代謝產(chǎn)物中不含過(guò)氧化氫或者含量極低，凝結(jié)芽孢桿菌BC99能起到抑菌作用的代謝產(chǎn)物可能是一種分泌在胞外的蛋白類的細(xì)菌素類物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99（Bacillus coagulans BC99）的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，考察其代謝產(chǎn)物粗品在不同預(yù)處理pH值、不同溫度、抑菌物質(zhì)粗品和菌液、不同酶處理后抑菌效果的影響，研究凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品的抑菌特性。結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有一定的抑制作用，且具有較強(qiáng)的廣譜抗菌效果；凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物粗品的抑菌效果最佳的預(yù)處理pH值在6左右；凝結(jié)芽孢桿菌BC99在37℃條件下，代謝產(chǎn)物粗品具有最高的抑菌活性。在溫度較低（4℃）或常溫（25℃）條件下，其抑菌活性還保持在一個(gè)比較好的水平，說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物抑菌物質(zhì)在冷藏保鮮中有作為一種生物保鮮劑，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的潛力，在這方面有待后續(xù)研究。通過(guò)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌BC99的代謝產(chǎn)物抑菌物質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行研究，在排除有機(jī)酸代謝產(chǎn)物和凝結(jié)芽孢桿菌BC99的菌體干擾后，用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、過(guò)氧化氫酶等多種酶處理代謝產(chǎn)物粗品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)過(guò)氧化氫酶不敏感，而對(duì)其它蛋白酶敏感，說(shuō)明凝結(jié)芽孢桿菌BC99代謝產(chǎn)物中主要的抑菌物質(zhì)可能是對(duì)蛋白酶敏感的細(xì)菌素類物質(zhì)。而這些細(xì)菌素類物質(zhì)仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，對(duì)其分子量大小、代謝含量、用法用量等方面進(jìn)行研究，為其在腸道菌群調(diào)節(jié)、食品保鮮、青貯飼料等領(lǐng)域的應(yīng)用，建立相關(guān)理論基礎(chǔ)。