劉恒閣，王海燕，吳文錦，高瑞昌，弋景剛，汪金林，白帆*，趙元暉*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.海信（山東）冰箱有限公司，山東 青島 266000；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；4.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；5.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)機電工程學(xué)院，河北 保定 071066；6.衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開發(fā)有限公司，浙江 衢州 324002）

羅非魚（Oreochromis mossambicus）屬于輻鰭魚綱鱸形目麗魚科羅非魚屬，原產(chǎn)于非洲，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）向全球推廣的優(yōu)良養(yǎng)殖淡水魚類。據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒2020》統(tǒng)計，2019年，我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量高達164萬噸[1]。羅非魚肉質(zhì)鮮嫩、魚刺較少、價格低廉、營養(yǎng)豐富，含有多種蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸與微量元素[2]。因此，羅非魚被廣泛應(yīng)用于魚類加工產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)品類型主要包括整條羅非魚、羅非魚片、羅非魚罐頭、羅非魚魚糜制品等[3-4]。

臭氧水是一種安全、環(huán)保、高效、廣譜的殺菌劑，其殺菌機理主要是O3分子產(chǎn)生氧自由基（O·），通過自由基鏈式反應(yīng)引起膜蛋白的氧化損傷，從而改變細胞膜的通透性，最終導(dǎo)致微生物裂解死亡[5-6]。通過臭氧水對水產(chǎn)品進行清洗殺菌處理，在國內(nèi)羅非魚加工與貯藏領(lǐng)域逐漸普及應(yīng)用[7]。然而，臭氧的強氧化性可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的氧化[8]，從而會對產(chǎn)品的營養(yǎng)成分產(chǎn)生不良影響。根據(jù)Bao等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，其強氧化性可能還會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解性與交聯(lián)聚集特性下降，從而影響產(chǎn)品的彈性與嫩度。目前，水產(chǎn)品加工過程中的殺菌處理仍是大多數(shù)加工企業(yè)的難題，而現(xiàn)有文獻對于臭氧水處理羅非魚的報道，大多為探究臭氧水殺菌的優(yōu)缺點以及對羅非魚殺菌后品質(zhì)的探究，針對羅非魚臭氧殺菌適宜殺菌工藝條件的報道仍較少。

基于以上問題，本文以臭氧水清洗殺菌裝置對羅非魚肉進行處理，確定臭氧水濃度后，通過對不同浸泡時間下羅非魚肉氣味成分差異、殺菌率、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化程度以及感官品質(zhì)的考察，探究臭氧水處理羅非魚肉的最佳工藝條件及其對魚肉品質(zhì)的影響，以期為臭氧水對羅非魚清洗殺菌技術(shù)的進一步優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吉富羅非魚：市售；牛血清白蛋白（生物試劑）：上海源葉生物科技有限公司；羰基含量檢測試劑盒、總巰基含量檢測試劑盒、Ca2+-ATPase檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；脂肪酸標準品、丁基羥基甲苯（均為優(yōu)級純）：西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；碘化鉀、硫酸、硫代硫酸鈉、氯化鉀、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、硫代巴比妥酸（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

去魚鱗設(shè)備（JL-10GY）、去魚內(nèi)臟設(shè)備（JL-70KF）：青島建亮科技有限公司；臭氧發(fā)生器（CF-G-3-20 g）：青島國林環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?；酶標儀（Powerwave XS）：美國Biotek儀器有限公司；多功能氮吹儀（SZ-N-20）：山東桑澤儀器儀表有限公司；氣相色譜儀（Agilent 7890 A）：安捷倫科技有限公司；電子鼻（iNose）：上海瑞玢智能科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 臭氧水的制備及濃度測定

1.3.1.1 臭氧水的制取

采用臭氧發(fā)生器制取臭氧，將新制取的臭氧氣體持續(xù)通入20 L、25℃的無菌蒸餾水中，并使氣體流速保持在2.0 L/min。通過改變臭氧氣體通入時間（1min～5 min），即可制得不同濃度的臭氧水[10]。

1.3.1.2 臭氧水濃度的確定

取100 mL新制得的臭氧水，加入20 mL 2%碘化鉀溶液與3 mL 0.5 mol/L硫酸，避光反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后加入1%淀粉溶液，此時溶液顯藍色。采用0.01 mol/L硫代硫酸鈉溶液進行滴定，滴定終點為藍色剛好消失并且30 s后不恢復(fù)藍色。

1.3.2 魚片的臭氧水處理

選取體表顏色、尺寸相近的鮮活羅非魚，采用高壓水去魚鱗和去魚內(nèi)臟設(shè)備對其進行處理。按圖1所示方法取魚肉，魚肉尺寸為3 cm×2 cm×0.5 cm。將魚肉片置于6倍體積的臭氧水中浸泡（容器為無菌的密閉容器），設(shè)定浸泡時間為5、10、15 min。同時以蒸餾水浸泡5 min作為對照。浸泡結(jié)束后，倒掉臭氧水，將魚肉片用封口袋封裝并標記，放入-4℃冰箱貯藏備用[7，10]。

圖1 取魚片方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of method of taking fish fillets

1.3.3 殺菌率的測定

取新制得的魚片樣品測定菌落總數(shù)。參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》測定。殺菌率計算公式如下[11]。

1.3.4 電子鼻試驗氣味成分分析

將相同浸泡時間下的魚肉分為兩組，分別進行生肉絞碎和蒸制3 min后的熟肉絞碎處理，處理后的魚肉稱取2 g置入50 mL棕色瓶中，采用封口膜密封，待氣體富集2 h后檢測。電子鼻采用頂空抽樣的方法取樣并檢測，同時獲取并記錄數(shù)據(jù)，檢測時間設(shè)定為90 s。取樣前后，軟件自動對傳感器進行清洗，清洗時間設(shè)定為120 s，每組設(shè)8個平行[12-13]。

1.3.5 蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化指標的測定

1.3.5.1 蛋白質(zhì)氧化指標的測定

1）肌原纖維蛋白的提?。禾崛》椒▍⒖糧hang等[14]的方法并適當修改。稱取魚肉樣品5 g，加入50 mL蒸餾水均質(zhì)1 min，于4℃下10 000 r/min離心15 min，棄上清，留沉淀。向沉淀中加入50 mL Tris-HCl緩沖液1（0.05 mol/L氯化鉀，0.02 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH 7.0），4℃攪拌30 min后于10 000 r/min離心15min，棄上清，留沉淀。向沉淀中加入50 mL Tris-HCl緩沖液2（0.6 mol/L氯化鉀，0.02 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH 7.0），4℃攪拌30 min后于10 000 r/min離心15 min，取上清液，即為肌原纖維蛋白樣液[14-19]。

2）肌原纖維蛋白含量的測定：測定方法參考福林酚法[15-16]。向 7 支試管中分別加入 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牛血清白蛋白溶液（0.25 mg/mL），用蒸餾水補足至1 mL，即為標準曲線溶液。取0.2 mL稀釋20倍的樣液，向其中加入1 mL試劑1（50 mL碳酸氫鈉+1 mL硫酸銅），即刻混勻，常溫反應(yīng)10 min。再向其中加入0.1 mL試劑2（福林酚），即刻混勻，于25℃下反應(yīng)30 min后，測定500 nm處吸光度。同時測定標準溶液與空白。繪制標準曲線，計算肌原纖維蛋白樣液濃度。

3）羰基含量的測定：參照羰基含量檢測試劑盒指導(dǎo)方法測定。

4）總巰基含量的測定：參照總巰基含量檢測試劑盒指導(dǎo)方法測定。

5）活性巰基含量的測定：參考薛勇[10]的方法并適當修改。取0.5 mL樣液，加入4.5 mLTris-HCl緩沖液3（2%十二烷基硫酸鈉，0.01 mol/L乙二胺四乙酸，0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH 6.8），于4℃下12 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加入0.1 mL Tris-HCl緩沖液4（0.1%二硝基苯甲酸，0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH 8.0），混勻，40℃反應(yīng)25 min，冷卻至常溫，測定412nm處吸光度。空白管采用0.5 mL Tris-HCl緩沖液2替代樣液進行測定。計算活性巰基含量公式如下。

式中：A為吸光度；ε為吸光系數(shù)，13 600 mL/（mol·cm）；Cpr為蛋白質(zhì)樣液濃度，mg/mL。

6）Ca2+-ATPase活力的測定：參照Ca2+-ATPase檢測試劑盒指導(dǎo)方法測定。

1.3.5.2 脂質(zhì)氧化指標的測定

硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的測定參照 GB 5009.181—2016《食品安全國家標準食品中丙二醛的測定》中第二法[20]。稱取魚肉樣品5 g，準確加入50 mL三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）混合液（7.5%三氯乙酸，0.1%乙二胺四乙酸二鈉），加塞密封，50℃振搖30 min，10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液，向其中加入2 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）水溶液，加塞密封，混勻，90℃水浴30 min，冷卻至常溫，測定532 nm處吸光度。同時測定標準溶液與空白。丙二醛含量計算公式如下。

式中：X為試樣中丙二醛含量，mg/kg；c為標準曲線測得的樣液中丙二醛濃度，μg/mL；V為試樣溶液定容體積，mL；m為最終試樣溶液所代表的試樣質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

1.3.6 感官評定

挑選12名經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的感官評定員組成評判小組，于感官評價室內(nèi)對臭氧水浸泡0、5、10、15 min后的樣品進行評分，評分標準參考文獻[21-24]的方法并適當修改，其中滋味評定需提前將各組殺菌后的魚肉進行3min的蒸制，評分標準見表1，4項指標各5分，總分為4項指標分數(shù)的平均值總和，滿分20分。

表1 感官評定標準Table 1 Criteria of sensory evaluation table

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗計量數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，使用Origin 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理，通過單因素和雙因素方差分析進行比較，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧水濃度的測試結(jié)果

臭氧水濃度是影響臭氧殺菌效果、操作環(huán)境及成本的關(guān)鍵因素，不同的臭氧通入時間對臭氧水濃度的影響見圖2。

圖2 不同臭氧通入時間下的臭氧水濃度Fig.2 Ozone water concentrations at different ozone entry times

由圖2可知，隨著臭氧通入時間的延長，臭氧水濃度增大。根據(jù)相關(guān)研究[7，10，12]，在通過臭氧水進行殺菌和脫腥的過程中，臭氧水濃度在0～6.000 mg/L，殺菌率提升較快，而當臭氧水濃度高于6.000 mg/L后，殺菌率隨溶液濃度變化不顯著，且操作過程中臭氧水濃度過高會導(dǎo)致操作環(huán)境氣味刺鼻、成本高以及耗時長等缺點。因此，本文選擇將臭氧水濃度控制在6.000 mg/L以內(nèi)，結(jié)合實際操作選擇采用臭氧通入時間為1、2、3 min的臭氧水，對應(yīng)濃度分別為（2.568±0.142）、（4.032±0.268）、（5.160±0.086）mg/L。

2.2 殺菌率測定結(jié)果

相同濃度下，不同浸泡時間對殺菌率的影響見圖3。

圖3 不同浸泡時間下的殺菌率Fig.3 Sterilization rate at different soaking times

由圖3可知，在同一臭氧水濃度下，殺菌率與浸泡時間呈正相關(guān)，并且浸泡時間5 min～10 min的增長速率明顯高于10 min～15 min。出現(xiàn)增長速率減緩這一現(xiàn)象的原因可能是隨著浸泡時間的延長，臭氧水濃度逐漸衰減，導(dǎo)致殺菌效果愈發(fā)微弱，從而殺菌率的增長速率愈發(fā)緩慢。而在同一浸泡時間下，殺菌率隨著臭氧水濃度的增大而升高，且不同濃度對應(yīng)的殺菌率具有顯著性差異（P＜0.05）。綜上所述，浸泡時間越長，臭氧水濃度越高，殺菌率也就越高，這與文獻[7，25]報道的結(jié)果相似。因此，為保證殺菌效果，后續(xù)指標的測定選擇采用濃度為5.160 mg/L的臭氧水對羅非魚片進行浸泡處理，此時魚肉的殺菌率為（74.000±0.017）%。

2.3 電子鼻分析

臭氧水浸泡殺菌可能對生、熟魚肉的氣味造成影響，通過電子鼻對不同臭氧水浸泡時間下的生、熟魚肉氣味成分分析，結(jié)果見圖4。

圖4 電子鼻氣味主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis diagram of electronic nose odor

由圖4可知，主成分1和2的總和均大于85%，說明兩者可代表主要的樣品信息。圖中不同浸泡時間下的代表各組分布區(qū)域均未分開。這說明在不同浸泡時間下的生魚肉、熟魚肉的氣味成分總體情況均無顯著性差異，即臭氧水處理對生羅非魚肉及熟制后的羅非魚肉氣味成分均無顯著性影響，這與文獻[13]報道的結(jié)果相似。

2.4 蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化程度

2.4.1 蛋白質(zhì)氧化程度

在蛋白質(zhì)氧化過程中，羰基化反應(yīng)是該過程的重要標志，羰基含量是評判蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標[26-27]。含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)或肽，其活性巰基中的氫原子易被自由基等活性基團取代，因此巰基含量也可直接體現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化程度[28]。肌球蛋白是肌原纖維蛋白中的重要組成部分，其分子構(gòu)象極易發(fā)生改變，這會導(dǎo)致Ca2+-ATPase活力降低。此外，蛋白質(zhì)分子重排也會導(dǎo)致Ca2+-ATPase活力降低。因此在蛋白質(zhì)氧化過程中，往往會伴隨Ca2+-ATPase活力的降低，其變化可從側(cè)面體現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化程度[29]。蛋白質(zhì)氧化程度結(jié)果見圖5。

圖5 不同浸泡時間對蛋白質(zhì)氧化指標的影響Fig.5 Effect of different soaking time on protein oxidation index

由圖5可知，隨著浸泡時間的延長，肌原纖維蛋白含量、巰基含量以及Ca2+-ATPase活力呈減小趨勢，羰基含量呈增大趨勢。其中15 min組的各項指標均與對照組具有顯著差異，而10 min組僅在巰基含量與Ca2+-ATPase活力方面與對照組具有顯著差異，5 min組僅在Ca2+-ATPase活力方面與對照組具有顯著差異。綜上所述，15min組的蛋白質(zhì)氧化損傷情況最為嚴重，這與文獻[14]報道的結(jié)果相似。結(jié)合2.2中不同浸泡時間下的殺菌率變化情況，推測臭氧水處理最優(yōu)浸泡時間為10 min。

2.4.2 脂質(zhì)氧化程度

在脂質(zhì)氧化過程中，最具有代表性的產(chǎn)物是丙二醛。通過TBARS的測定，可得知丙二醛的含量，從而推測脂質(zhì)氧化的程度[30-31]。脂質(zhì)氧化程度結(jié)果見圖6。

圖6 不同浸泡時間對TBARS的影響Fig.6 Effect of different soaking time on TBARS

由圖6可知，隨著浸泡時間的延長，TBARS含量呈現(xiàn)出增大的趨勢。浸泡時間為10 min及以上時，脂質(zhì)氧化指標與對照組的差異顯著，脂質(zhì)氧化的程度也逐漸強烈。其中15 min組的脂質(zhì)氧化損傷情況最為嚴重，這與文獻[14，25]報道的結(jié)果相似。結(jié)合2.2和2.4.1中不同浸泡時間下的殺菌率變化以及蛋白質(zhì)氧化程度，推測臭氧水處理最優(yōu)浸泡時間為10 min。

2.5 感官分析

臭氧水處理對羅非魚肉感官品質(zhì)的影響見圖7。

圖7 不同浸泡時間對羅非魚肉感官品質(zhì)的影響Fig.7 Effects of different soaking time on sensory quality of tilapia fish

由圖7可知，隨著浸泡時間的延長，魚肉的感官品質(zhì)逐漸下降，其中浸泡0～10 min的魚肉感官評分下降不顯著（P>0.05）；而當浸泡時間大于10 min時，魚肉的感官品質(zhì)顯著降低（P<0.05），綜合上述殺菌率、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)氧化程度結(jié)果，這可能是由于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)氧化程度加劇，影響了魚肉的滋味、外觀及質(zhì)地等品質(zhì)，這與文獻[2，7]報道結(jié)果相似。綜上所述，確定臭氧水處理最優(yōu)浸泡時間為10 min。

3 結(jié)論

本文通過臭氧水清洗殺菌裝置對羅非魚肉進行了處理。通過對魚肉殺菌率、氣味成分差異、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化程度以及感官品質(zhì)的考察，確定臭氧水處理羅非魚肉的最佳工藝條件并探究了其對羅非魚肉品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，當臭氧水濃度為5.160 mg/L、浸泡時間為10 min時，清洗殺菌效果最佳，殺菌率可達（74.00±0.017）%。此時，羅非魚生肉、熟肉的電子鼻氣味成分分布域重疊率高，肌原纖維蛋白、羰基、總巰基、丙二醛含量和Ca2+-ATPase活力分別為2.5mg/mL、4.1nmol/mg、0.08 μmol/mg、0.36 mg/kg、2.6 U/mg，說明魚肉的氣味成分變化較小，且蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化程度均不強烈。同時，魚肉的感官評分保持為17.99分，感官品質(zhì)完好。本文采用的裝置還有改進與優(yōu)化的空間，具體改進思路可參考固態(tài)聚合物電解質(zhì)（solid polymer electrolyte，SPE）電解法，同時還可結(jié)合超聲處理等技術(shù)，從而進一步優(yōu)化清洗殺菌工藝。此外，對于該技術(shù)對魚肉風(fēng)味（氣味與滋味）影響的研究，還可利用高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、氣相色譜-嗅味計等儀器進行分析，深入考察風(fēng)味組分在該過程中受到的影響。