文良柱，方宏清，韋炎龍，竇俊

（江蘇萬邦醫(yī)藥科技有限公司，江蘇徐州 221004）

羧肽酶B（Carboxypeptidases B，CPB）是一種含金屬鋅的蛋白酶，可水解蛋白質(zhì)或多肽類底物C端的精氨酸（Arg）或賴氨酸（Lys），在藥物的生產(chǎn)、科學研究以及急性胰腺炎的診斷等方面具有重要作用[1-2]。特別是在胰島素原轉(zhuǎn)化為胰島素的過程中，CPB是不可缺少的工具酶之一[3]。目前，活性CPB的制備方法主要分為兩種：（1）直接從豬胰腺中提取并純化，但是這種方法價格昂貴，且制品中殘留其他酶類或病毒等，限制了其應(yīng)用范圍；（2）利用微生物（原核或真核表達系統(tǒng)）發(fā)酵的方法表達CPB的酶原（proCPB），純化后去除N末端前肽獲得具有催化活性的酶體[4-5]。相比于真核表達系統(tǒng)，原核表達系統(tǒng)，尤其是大腸桿菌（Escherichia coli），具有遺傳背景清晰、基因工程操作手段成熟、宿主生長能力強等優(yōu)點，是理想的外源蛋白表達宿主之一。但是，大腸桿菌表達包括豬羧肽酶原B（proCPB）在內(nèi)的很多外源蛋白均是以包涵體的形式存在于細胞中，后續(xù)還需對產(chǎn)物進行復(fù)性，操作復(fù)雜且復(fù)性率低[6]。

CPB含有7個半胱氨酸，其中1個半胱氨酸呈游離態(tài)，另外6個形成3對二硫鍵。大腸桿菌缺乏真核細胞中翻譯后修飾的酶類，并且細胞質(zhì)環(huán)境呈還原型，不利于二硫鍵形成，外源蛋白極易形成包涵體。在宿主細胞中，將外源蛋白從包涵體轉(zhuǎn)為天然構(gòu)象并以可溶性蛋白的形式存在，可降低蛋白質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)成本。一些輔助蛋白能夠協(xié)助蛋白質(zhì)組裝或介導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊，將目的蛋白與之共表達是避免包涵體形成的有效手段之一。常用的輔助蛋白包括熱休克蛋白分子伴侶以及一些參與蛋白質(zhì)異構(gòu)化反應(yīng)的酶類，如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）、肽酰-脯氨酰順反異構(gòu)酶（Peptidyl-Prolylcis-transIsomerase，PPI）等。

在真核細胞中，PDI是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上氧化蛋白折疊的關(guān)鍵酶，氧化底物后自身被還原，隨后被巰基氧化酶（Sulfhydryl Oxidase，SO）重新氧化[7]。因此，構(gòu)建SO-PDI聯(lián)合表達體系，有望實現(xiàn)proCPB的可溶性表達。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

CPB甘油菌（E.coliBL21(DE3)/p0E-TS/pETCPB）的宿主E.coliBL21（DE3），貨號CB105-01，天根生化科技（北京）有限公司。

蛋白胨、酵母提取物，英國OXOID公司；瓊脂粉、氯化鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖，法國Biowest公司；氯霉素、卡那霉素、四環(huán)素，美國AMRESCO公司；重組克隆試劑盒（CU201-02），北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器

HR40-ⅡA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；UV-2100紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；202-OAB電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HNY-200B臺式全溫控搖床，天津歐諾儀器股份有限公司；HW.SY11-KP2恒溫水浴鍋，北京長風儀器儀表公司；H2O3-100C金屬浴，卡尤迪生物科技（北京）有限公司；Veriti PCR擴增儀，美國ABI公司；3K-18KS離心機，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；DYY-2C電泳儀，北京市六一儀器廠；BL-620S電子天平，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

所有質(zhì)粒的體外重組操作利用重組克隆試劑盒完成，詳細信息如表1所示。

表1 質(zhì)粒信息

1.2.2 培養(yǎng)條件及蛋白表達

挑取單菌落至含有5 mL液體LB培養(yǎng)基的試管中，在37 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)10～12 h。氨芐青霉素（Amp，50 μg/mL）、氯霉素（Cm，25 μg/mL）和卡那霉素（Kan，25 μg/mL）根據(jù)質(zhì)粒所攜帶抗生素基因按照要求使用。

挑取單菌落至含有5 mL液體LB培養(yǎng)基的試管中，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)10～12 h。將菌液轉(zhuǎn)接至含有50 mL液體LB培養(yǎng)基的搖瓶中，使初始OD600為0.1，在37 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)。以菌株E. coliBL21(DE3)為宿主時，如外源蛋白啟動子為阿拉伯糖，則在OD600為0.3～0.4時加入2 mg/mL的L-阿拉伯糖；如外源蛋白啟動子為T7，則在OD600為0.6～0.8時加入0.3 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）。在20 ℃、200 r/min的條件下繼續(xù)培養(yǎng)15 h，收集菌體并稀釋到合適的濃度，超聲破碎分離可溶性蛋白和包涵體蛋白，總蛋白樣品不進行超聲破碎。利用SDS-PAGE電泳對蛋白表達進行鑒定。

1.2.3 菌株傳代培養(yǎng)

將保藏的CPB甘油菌涂布于含有Amp和Cm的LB平板，倒置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中孵育約20 h。挑取單菌落至含有Amp和Cm液體LB培養(yǎng)基（5 mL）的試管中，37 ℃、200 r/min孵育約12 h，記為第0代；吸取50 μL第0代菌液至含有Amp和Cm的液體LB培養(yǎng)基（5 mL）中，37 ℃、200 r/min孵育約12 h，記為第1代（有抗）……如此操作直至獲得第21代（有抗）。

在第0代菌液基礎(chǔ)上，按照上述的傳代培養(yǎng)方法，但全過程不添加抗生素，獲得第11代（無抗）和第21代（無抗）。同樣按照1.2.2蛋白表達方法，但全過程不添加抗生素，研究不添加抗生素時可溶性表達系統(tǒng)穩(wěn)定性。

1.2.4 基因

SO蛋白質(zhì)序列參照來源于釀酒酵母（SaccharomycescerevisiaeS288C）的ERV1（NCBI VERSION：P27882.2）設(shè)計改造，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成對應(yīng)基因并克隆到pUC57載體上（pUC57-ERV1）。

PDI來源于人（hPDI）或釀酒酵母（sPDI）或大腸桿菌（DsbC），hPDI的氨基酸序列參照NCBI VERSION：NP_000909.2序列設(shè)計改造，sPDI的氨基酸序列參照NCBI VERSION：AAA34848.1序列，DsbC的核酸序列（dsbC）來源于E. coliBL21(DE3)基因組（NCBI VERSION：CP001509.3）。這三個蛋白對應(yīng)的基因序列連同RBS序列、終止子序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到pUC57載體上，獲得質(zhì)粒pUC57-hPDI、pUC57-sPDI和pUC57-dsbC。

proCPB的蛋白序列來源于歐亞野豬（Sus scrofa，NCBI VERSION：CAB46991.1），但去掉2～15位信號肽氨基酸序列，核酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到到質(zhì)粒pET21b骨架NdeI、XhoI位點上，獲得質(zhì)粒pETCPB。

2 結(jié)果與分析

2.1 N末端標簽優(yōu)化策略實現(xiàn)SO和PDI的可溶性表達

誘導(dǎo)菌株 BL21(DE3)、WF1、WF2及 WF3表達對應(yīng)的巰基氧化酶（ERV1）和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（hPDI、sPDI或DsbC），可溶性蛋白和包涵體蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1（A）所示，ERV1（21.70 kDa）、hPDI（52.05 kDa）、sPDI（55.70 kDa）和DsbC（23.51 kDa）均未出現(xiàn)明顯條帶。將巰基氧化酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因的啟動子更換為強度更強的T7啟動子，可溶性蛋白和包涵體蛋白SDSPAGE電泳結(jié)果如圖1（B）所示。結(jié)果表明，更換啟動子仍不能實現(xiàn)hPDI和sPDI的可溶性表達。

圖1 巰基氧化酶和二硫鍵異構(gòu)酶的蛋白表達

優(yōu)化ERV1、hPDI、sPDI或DsbC的N末端標簽（添加Trx標簽、T7標簽或GST標簽）增強蛋白的可溶性表達能力。如圖2（A）所示，ERV1、TrxERV1、T7ERV1以及GSTERV1均能夠產(chǎn)生可溶性蛋白，TrxERV1可溶性表達效果最優(yōu)、ERV1次之；如圖2（B）所示，TrxhPDI、T7hPDI以及GSThPDI可溶性表達效果較好，而hPDI表達效果不理想，總蛋白樣品也未見明顯條帶；如圖2（C）所示，TrxsPDI具有很高的蛋白表達量以及很好的可溶性表達效果，T7sPDI和GSTsPDI有一定的可溶性表達，sPDI表達效果不理想；如圖2（D）所示，DsbC、TrxDsbC、T7DsbC以及GSTDsbC均能夠產(chǎn)生可溶性蛋白。

圖2 添加N末端標簽的SO和PDI的蛋白表達.

結(jié)果表明，通過添加N末端標簽策略hPDI和sPDI的表達水平顯著提高，并實現(xiàn)了可溶性表達。

2.2 可溶性表達系統(tǒng)的構(gòu)建以及proCPB的可溶性表達

優(yōu)選ERV1或TrxERV1分別與TrxsPDI、GSTsPDI、TrxhPDI、T7hPDI、GSThPDI或DsbC組合，它們在來源于Salmonella enterica的阿拉伯糖啟動子控制下，利用p15A ori-CmR骨架，可與裝載目的基因的pET系列載體配合使用。

培養(yǎng)菌株第0～3代，并誘導(dǎo)表達proCPB（45.97 kDa），豬羧肽酶原B以包涵體的形式存在于細胞中（圖3）。研究proCPB與添加了N末端標簽的SO-PDI共表達的效果，以E. coliBL21(DE3)為宿主，裝載質(zhì)粒pETCPB與可溶性表達系統(tǒng)質(zhì)粒（p0E-TS、p0E-GS、p0E-TH、p0E-7H、p0E-GH、p0E-0D、pTE-TS、pTE-GS、pTE-TH、pTE-7H、pTE-GH或pTE-0D）。加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖和IPTG，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，ERV1-TrxsPDI和TrxERV1-TrxsPDI是優(yōu)異的可溶性表達系統(tǒng)，可實現(xiàn)proCPB可溶性表達，而其他10種組合未能實現(xiàn)proCPB可溶性表達，證明SO-PDI作為可溶性表達系統(tǒng)可行，能夠用于目的蛋白的可溶性表達。

圖3 proCPB的表達

圖4 proCPB與SO-PDI系統(tǒng)的共表達.

2.3 更換可溶性表達系統(tǒng)ERV1-TrxsPDI的啟動子對proCPB表達可溶性的影響

以控制可溶性表達系統(tǒng)ERV1-TrxsPDI的啟動子為單變量，將阿拉伯糖啟動子變更為T7啟動子，研究啟動子或誘導(dǎo)劑對目的蛋白可溶性表達的影響，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，可溶性表達系統(tǒng)ERV1-TrxsPDI仍可促進目的蛋白proCPB可溶性表達，不受啟動子種類限制。

圖5 T7啟動子對proCPB可溶性表達的影響

2.4 單獨表達ERV1或TrxsPDI對proCPB表達可溶性的影響

為研究單獨表達ERV1或TrxsPDI對目的蛋白proCPB表達可溶性的影響，構(gòu)建質(zhì)粒p0E和pTS分別裝載ERV1基因和TrxsPDI基因，結(jié)果如圖6所示。ERV1與proCPB共表達時，proCPB主要以包涵體的形式存在，且部分ERV1也以包涵體的形式存在；TrxsPDI與proCPB共表達時，TrxsPDI對proCPB的可溶性表達能夠起到一定促進作用，但是大量的蛋白還是以包涵體的形式存在。結(jié)果表明，proCPB的可溶性表達是在SO-PDI共同作用下實現(xiàn)的。

圖6 ERV1或TrxsPDI單獨表達對proCPB可溶性表達的影響

2.5 可溶性表達系統(tǒng)穩(wěn)定性

選擇CPB0、CPB11、第21代（無抗）（CPB11 Gen 21st）和第21代（有抗）（CPB11 Gen 21st(AC)）進行蛋白表達，如圖7所示。結(jié)果表明，傳代10天后proCPB仍可進行可溶性表達。利用大腸桿菌表達目的蛋白的一個工業(yè)生產(chǎn)周期（從種子培養(yǎng)到大規(guī)模發(fā)酵結(jié)束）通常少于10天，表明本研究的可溶性表達系統(tǒng)具有在工業(yè)生產(chǎn)中使用的潛力。

圖7 可溶性表達proCPB的穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本文通過篩選不同來源的二硫鍵異構(gòu)酶聯(lián)用優(yōu)化N末端標簽構(gòu)建了一種新型可溶性表達系統(tǒng)，并成功實現(xiàn)豬羧肽酶原B的可溶性表達。該系統(tǒng)不受誘導(dǎo)劑和啟動子限制，具有傳代穩(wěn)定性，可在工業(yè)生產(chǎn)中使用。