李一華，徐賢柱

（江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330022）

絲狀真菌俗稱霉菌，是具有發(fā)達(dá)菌絲體且不產(chǎn)生大型子實(shí)體的一類異養(yǎng)真核生物。絲狀真菌通常附著在有機(jī)物上生長(zhǎng)，是地球上出現(xiàn)最早且分布最廣的生物類群[1]。絲狀真菌廣泛存在于陸地土壤、水體及水體沉積物中，或以內(nèi)生真菌的形式存在于植物根系或內(nèi)部。絲狀真菌是生物活性天然化合物的重要來源，其產(chǎn)物包括抗生素、多肽、多糖及植物激素等，其中部分產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌等作用，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域都得到了不同程度的應(yīng)用[2]。

1 絲狀真菌的培養(yǎng)

1.1 半合成固體培養(yǎng)基培養(yǎng)

半合成固體培養(yǎng)基性質(zhì)穩(wěn)定，能夠比較清晰地呈現(xiàn)絲狀真菌的特征，往往用于絲狀真菌的分離、鑒定與保藏。市售用于培養(yǎng)絲狀真菌的半合成固體培養(yǎng)基主要為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），此外有沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基等[3]。李志克等[4]從四川省阿壩州茂縣溝口鎮(zhèn)與疊溪鎮(zhèn)花椒園取根腐病花椒病根樣本，使用組織分離法，切取5 mm×5 mm樣本，在PDA試管斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，分離出了該種花椒根腐病的病原菌腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）。

1.2 半合成液體培養(yǎng)基培養(yǎng)

抗生素生產(chǎn)工業(yè)得到發(fā)展以后，液體發(fā)酵技術(shù)在真菌發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。用液體發(fā)酵的方式培養(yǎng)絲狀真菌具有周期短、效率高、產(chǎn)量高及可連續(xù)等優(yōu)勢(shì)，發(fā)酵液中還會(huì)產(chǎn)生氨基酸、維生素、酶等多種化合物，因此是十分理想的絲狀真菌產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)方式[5]。用于絲狀真菌培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基內(nèi)往往包括碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等成分[6]。此外，在實(shí)際的生產(chǎn)發(fā)酵中，需要根據(jù)生產(chǎn)的不同需求及生產(chǎn)菌種的不同特性，針對(duì)性地對(duì)培養(yǎng)基成分（如碳源、氮源）進(jìn)行改良，以達(dá)到高效生產(chǎn)的目的。

1.3 天然固體培養(yǎng)基培養(yǎng)

以木屑、大米、馬鈴薯等天然營養(yǎng)成分為來源的培養(yǎng)基也可以用于絲狀真菌的培養(yǎng)。部分天然培養(yǎng)基的原材料為農(nóng)作物余料或副產(chǎn)物，具有來源豐富、價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)。王麗芳等[7]使用木屑基礎(chǔ)培養(yǎng)基（木屑78%、石膏1%、玉米粉20%、蔗糖1%及固體基料重量80%的水，混合均勻取自然pH）對(duì)野生痂狀炭角菌（Xylaria escharoidea）進(jìn)行培養(yǎng)，并以基料重量1%的比例添加氨基酸，對(duì)木屑培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。白永軍等[8]使用大米培養(yǎng)基培養(yǎng)黃曲霉（Aspergillus flavus），并從大米培養(yǎng)基發(fā)酵液中分離鑒定出5種不同的次生代謝產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用大米作為黃曲霉的培養(yǎng)基質(zhì)可以在控制成本的同時(shí)得到豐富的產(chǎn)物。

2 絲狀真菌產(chǎn)物的種類與應(yīng)用

2.1 生產(chǎn)抗生素

人類利用抗生素已有近90年的歷史。如青霉素的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了抗生素工業(yè)的發(fā)展，催生了大量與抗生素相關(guān)的研究。然而，野生絲狀真菌菌株往往在產(chǎn)量上不能滿足生產(chǎn)的需求，生產(chǎn)上應(yīng)用的工業(yè)菌株往往經(jīng)過了不同手段的菌株改良，其效價(jià)和生產(chǎn)率與原始菌株相比高出3～5個(gè)數(shù)量級(jí)。段志鋼等[9]采用高能電子誘變技術(shù)對(duì)黃青霉菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，并結(jié)合高通量篩選方法，得到了青霉素高產(chǎn)的黃青霉菌菌株B13-15-36。該菌株發(fā)酵單位可達(dá)到14萬U/mL，較之前提高了46%，同時(shí)優(yōu)化了青霉素發(fā)酵工藝，得到了更低成本、更高效率的青霉素生產(chǎn)方法。

2.2 生產(chǎn)脂質(zhì)

絲狀真菌是優(yōu)良的脂質(zhì)來源。如高山被孢霉（Mortierella alpina）是一種具有代表性的產(chǎn)油絲狀真菌，菌絲油脂含量高達(dá)自身干重的50%以上，產(chǎn)物多為長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。目前，高山被孢霉主要用于生產(chǎn)其胞內(nèi)油花生四烯酸（Arachidonic Acid，ARA），現(xiàn)已作為商業(yè)菌株被廣泛投入生產(chǎn)。高山被孢霉產(chǎn)脂條件優(yōu)化也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。CHANG等[10]提出了高山被孢霉發(fā)酵花生四烯酸的一系列優(yōu)化方案，包括以正己烷作為氧載體或提高氧分壓提高溶解氧（DO）、采用分批補(bǔ)料系統(tǒng)維持有利于脂質(zhì)積累的碳氮比、選擇廉價(jià)復(fù)合氮源等。這些方法均能在控制生產(chǎn)成本的前提下提高高山被孢霉的脂質(zhì)生產(chǎn)效率。

2.3 生產(chǎn)蛋白質(zhì)類產(chǎn)物

絲狀真菌可以通過頂端分泌的方式經(jīng)胞吐作用分泌蛋白質(zhì)，具有優(yōu)越的蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力。與原核生物相比，絲狀真菌具有成熟的翻譯后修飾系統(tǒng)，在用于生產(chǎn)各類蛋白質(zhì)產(chǎn)物時(shí)具有諸多優(yōu)勢(shì)。目前，市面上有超過50%的商用蛋白質(zhì)都來源于絲狀真菌。

絲狀真菌本身可以產(chǎn)生種類多樣的酶，經(jīng)過分離篩選可以得到具有生產(chǎn)潛力的優(yōu)良菌株。馮欣欣等[11]從新疆寒冷地區(qū)腐木中的真菌進(jìn)行了6次分離和純化，共得21個(gè)目標(biāo)菌株，采用DNS法篩選出具有纖維素酶（CMC）活性的菌株，鑒定結(jié)果分別為脈紋孢菌（Neurospora sitophila）、桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride）和產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）。實(shí)驗(yàn)表明，這些菌株均具有在低溫條件下生產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良特性。HE等[12]建立了一種將熒光激活細(xì)胞分選（FAC）技術(shù)與紅色熒光蛋白DsRed表達(dá)偶聯(lián)的高通量篩選方法，用于分離纖維素酶高產(chǎn)的里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株，并使用該方法成功篩選出了兩株纖維素酶高產(chǎn)的里氏木霉菌株，其纖維素酶活性分別較普通菌株高出46%和27%，驗(yàn)證了該方法用于篩選高產(chǎn)菌株的可行性。

絲狀真菌經(jīng)過基因工程等技術(shù)改造，亦可以用于生產(chǎn)異源蛋白。ARAKI等[13]運(yùn)用減毒選擇標(biāo)記法標(biāo)記大豆黃曲霉的啟動(dòng)子區(qū)域并將其截?cái)?，成功引入了異源蛋白的表達(dá)基因，建立了大豆黃曲霉異源蛋白高水平表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)在非選擇性培養(yǎng)基上也能維持其蛋白產(chǎn)量，可用于產(chǎn)業(yè)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

2.4 生產(chǎn)色素

生物色素可以從植物、動(dòng)物和微生物中獲得，這些天然來源的色素往往具有生物可降解、環(huán)境友好、毒性較低等優(yōu)點(diǎn)。其中，動(dòng)植物生產(chǎn)的色素具有色素不穩(wěn)定、溶解性高、生產(chǎn)依賴季節(jié)等缺點(diǎn)，相比之下微生物具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)物穩(wěn)定且不受季節(jié)影響的優(yōu)點(diǎn)。而在微生物中，真菌不需要陽光、受外界因素影響較小，最適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來，不斷有新的真菌被發(fā)現(xiàn)具有生產(chǎn)色素的能力，這些真菌廣泛存在于海洋、陸地土壤及紅樹林生態(tài)系統(tǒng)等環(huán)境中。例如，拜萊青霉（Penicillium bilaii）是一種從澳大利亞塔斯馬尼亞休恩港分離的海洋真菌，能夠產(chǎn)生黃色真菌色素；新南威爾士州沙爾維附近采集的一種青霉分離菌被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生黃色色素等。

2.5 生產(chǎn)有機(jī)酸

有機(jī)酸是微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的重要物質(zhì)。絲狀真菌可以產(chǎn)生種類多樣的有機(jī)酸，其中不乏具有抗菌、抗氧化等生物活性的優(yōu)良產(chǎn)物。檸檬酸是一種重要的平臺(tái)化合物，目前作為化學(xué)產(chǎn)品的檸檬酸主要來自絲狀真菌黑曲霉深層液體發(fā)酵。HU等[14]總結(jié)了絲狀真菌黑曲霉的檸檬酸生產(chǎn)與優(yōu)化策略，包括利用代謝工程手段使得黑曲霉的糖化酶基因過度表達(dá)、利用等離子體誘變得到高產(chǎn)突變株、優(yōu)化培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件等。這些手段往往能使黑曲霉菌株的檸檬酸產(chǎn)量較原始水平有很大幅度的提高，較大限度地發(fā)揮黑曲霉的生產(chǎn)能力。

2.6 其他產(chǎn)物

除了上述產(chǎn)物以外，在真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中還有大量結(jié)構(gòu)新穎的生物活性化合物被不斷發(fā)現(xiàn)。劉碧麗等[15]使用乙酸乙酯萃取及減壓硅膠柱洗脫等方法對(duì)一株海底沉積物來源的青霉菌（Penicillium polonicumH92）進(jìn)行分離純化與液體發(fā)酵，從發(fā)酵液中分離出7種次生代謝產(chǎn)物，包括4個(gè)喹啉酮類化合物、2個(gè)二酮哌嗪類化合物和1個(gè)生物堿，其中部分化合物被證明對(duì)流感病毒神經(jīng)氨酸酶具有抑制活性。趙江源等[16]對(duì)一種土壤真菌煙曲霉（Aspergillus fumigatus）的固態(tài)發(fā)酵物采用硅膠柱層析和Sephadex LH-20分離純化，并使用核磁共振波譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，分離出13種化合物。在后續(xù)的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中，證明化合物8（ourosperone A）對(duì)ABTS＋（IC50為0.155 mg/mL）、DPPH（IC50為3.453 mg/mL）自由基具有一定的清除效果。

ORBAN等[17]提出，絲狀真菌來源的芳香性物質(zhì)在許多產(chǎn)業(yè)尤其是食品產(chǎn)業(yè)也具有巨大的應(yīng)用前景。許多絲狀真菌能夠產(chǎn)生兼具營養(yǎng)與風(fēng)味的特殊成分，包括多種醇類、酮類和酯類化合物。這些具有芳香氣味的化合物能為發(fā)酵類的食物提供特有的風(fēng)味與營養(yǎng)價(jià)值，作為食品添加劑或香料也具有優(yōu)秀的潛力。

3 結(jié)語

絲狀真菌作為一種常見的微生物，對(duì)其培養(yǎng)與利用已具有漫長(zhǎng)且深厚的基礎(chǔ)；20世紀(jì)青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，絲狀真菌及其產(chǎn)物的研究更是進(jìn)入了新的紀(jì)元。絲狀真菌分布廣泛、種類繁多、容易大規(guī)模培養(yǎng)，且多數(shù)具有性質(zhì)穩(wěn)定、環(huán)境友好、毒性較低或無毒的優(yōu)點(diǎn)，是非常理想的產(chǎn)業(yè)化微生物，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等許多領(lǐng)域都占據(jù)了重要的地位。然而到目前為止，還有許多絲狀真菌的發(fā)酵產(chǎn)業(yè)處于產(chǎn)率較低、產(chǎn)物品質(zhì)較差的狀態(tài)，許多優(yōu)化手段也還停滯在試驗(yàn)階段。此外，部分絲狀真菌菌種還具有會(huì)自身降解產(chǎn)物、產(chǎn)量不穩(wěn)定、培養(yǎng)條件復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，如何有效優(yōu)化培養(yǎng)方式并投入應(yīng)用、如何選育高產(chǎn)且穩(wěn)定的優(yōu)良菌株是絲狀真菌資源研究的當(dāng)務(wù)之急。

近年來不斷有新穎的化合物從絲狀真菌中被分離，但其中許多化合物的具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生機(jī)理還未能明了。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展及聯(lián)合質(zhì)譜等技術(shù)的跟進(jìn)，絲狀真菌及其產(chǎn)物的應(yīng)用還有著無限的可能性。