高雪峰 張銳 余旭輝 余力

由于不良飲食和生活習慣等因素，導致我國食管癌發(fā)病率逐年升高，根據(jù)2019年國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示食管癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第六位，而死亡率則位居第五位[1]。我國食管癌多為食管鱗癌，其早期癥狀不明顯致使許多患者病情延誤，而晚期食管鱗癌由于無法手術(shù)切除、遠處轉(zhuǎn)移等因素導致患者生存質(zhì)量和5年存活率均較低[2]。目前除傳統(tǒng)放、化療外靶向治療和生物免疫治療在食管鱗癌的治療中發(fā)揮重要作用，但患者存活率并無明顯提高[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關因子1(metastasis associated protein 1，MTA1)的高表達能夠促進腫瘤血管生成，增強腫瘤細胞侵襲能力，在許多腫瘤中表達異常增高[4]；轉(zhuǎn)化生子因子激活激酶1(transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1)屬于蛋白激酶MAP3Ks家族成員，能夠被多種炎性細胞因子激活參與NF-κB通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮促進腫瘤生長的作用[5]；而腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)通過調(diào)控JAK2/STAT3通路和NF-κB通路發(fā)揮促腫瘤的作用[6]。但MTA1、TAK1和TRAF6在食管鱗癌中的表達水平及意義尚不完全明確，因此本研究通過檢測三者在食管鱗癌中的表達水平并分析其與患者臨床病理特征和預后的關系，旨在為食管鱗癌的診斷、治療和預后評估提供相關依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 篩選2016年3月至2018年3月于我院普外科行食管癌切除術(shù)的107例食管鱗癌患者腫瘤組織及癌旁組織(腫瘤組織邊緣>2 cm的組織)，其中男77例，女30例，平均年齡(58.19±8.33)歲；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期患者61例，Ⅲ/Ⅳ期患者46例；未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者58例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者49例。患者及家屬均簽署對研究知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核并批準。

1.2 納排與排除標準

1.2.1 納入標準：①患者均為初診食管鱗癌，術(shù)前未接受放、化療，靶向治療及生物免疫治療；②患者術(shù)中病理及細胞學檢查明確診斷為食管鱗癌，診斷依據(jù)《食管癌診療規(guī)范(2018版)》[7]；③患者臨床資料完整，無丟失或遺漏；④患者未合并其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病和精神神經(jīng)疾病等。

1.2.2 排除標準：①患者術(shù)前接受過放、化療，靶向治療及生物免疫治療；②患者術(shù)中病理診斷非食管鱗癌或食管良性病變；③患者臨床病理資料缺失或遺漏。

1.3 方法

1.3.1 試劑與耗材:MTA1、TAK1、TRAF6兔抗人單克隆抗體均購自美國CST公司，免疫組織化學法試劑盒及蘇木精染色液、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DBA)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer salin，PBS)、免疫組化抗原修復液等均購自美國Thermo Fisher公司，復合光學顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.3.2 免疫組織化學法檢測MTA1、TAK1、TRAF6表達情況:MTA1、TAK1、TRAF6抗體均按照1∶100比例進行稀釋，患者腫瘤組織及癌旁組織標本采用4%多聚甲醛固定，脫水包埋獲取石蠟標本，組織切片機切片后經(jīng)烤片、脫蠟、水化等步驟，滴加抗原修復液微波15 min 修復抗原，嚴格按照試劑盒中說明書所示步驟進行操作。參照染色強度記分：無染色記0分、淺黃色記1分、棕黃色記2分、深棕色記3分。再參照陽性細胞密度打分：高表達細胞≤25%記 1分，26%～50% 記2分，>50% 記3分。依據(jù)文獻描述[8-10]將上述兩項評分相乘獲得結(jié)果，結(jié)果≤3分為陰性表達，>4分為陽性表達。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，Graphpad Prism 7.0軟件制作圖表。計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier生存曲線比較患者36個月生存情況，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤及癌旁組織中MTA1、TAK1、TRAF6表達情況 免疫組化結(jié)果顯示MTA1、TAK1、TRAF6在腫瘤組織中陽性率為74.77%、79.44%、68.22%，而癌旁組織中陽性率為29.91%、24.29%、34.58%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 腫瘤及癌旁組織MTA1、TAK1、TRAF6表達情況 n=107

2.2 腫瘤組織MTA1、TAK1、TRAF6表達情況與患者臨床病理特征的關系 將腫瘤組織MTA1、TAK1、TRAF6表達與患者臨床病理特征比較，MTA1、TAK1、TRAF6與患者性別、年齡無關(P>0.05)，但與腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關(P<0.05)。見表2～4。

表2 組織MTA1與患者臨床病理特征的關系 例

表3 組織TAK1與患者臨床病理特征的關系 例

2.3 組織MTA1、TAK1、TRAF6表達情況與患者預后的關系 對患者采用微信、電話、門診復查等方式進行隨訪，隨訪間隔3個月，隨訪患者死亡或隨訪時間截至2021年3月，共36個月。107例食管鱗癌患者存活60例，死亡45例，失訪2例，死亡患者均死于食管鱗癌復發(fā)、進展或相關并發(fā)癥，未發(fā)現(xiàn)死于其他疾病的案例。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中MTA1、TAK1、TRAF6陽性表達患者3年生存率明顯低于陰性表達患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

表4 組織TRAF6與患者臨床病理特征的關系 例

圖1 食管鱗癌組織中MTA1、TAK1、TRAF6表達情況與患者生存率的關系；A 食管鱗癌組織中MTA1與患者生存率的關系；B 食管鱗癌組織中TAK1與患者生存率的關系；C 食管鱗癌組織中TRAF6與患者生存率的關系

3 討論

食管鱗癌是我國食管癌最常見的病理學類型，由于其早期診斷較為困難常導致患者預后不良的發(fā)生，研究表明我國食管鱗癌患者5年生存率低于40%[11]。研究表明食管鱗癌是一種多基因、多環(huán)節(jié)、多因素共同作用形成的惡性腫瘤，改善食管鱗癌患者預后、延長患者生存時間、提高患者生活質(zhì)量是目前急需解決的重要問題[12]，故需要尋找與食管癌預后相關的分子靶點在食管鱗癌的診斷及治療中具有重大意義。

本研究采用免疫組化法檢測食管鱗癌組織中MTA1、TAK1、TRAF6表達情況，發(fā)現(xiàn)三者在腫瘤組織中陽性表達率明顯高于癌旁組織，且MTA1、TAK1、TRAF6陽性表達均與患者腫瘤臨床分期、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小相關，提示MTA1、TAK1、TRAF6促進了食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并為腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。腫瘤組織中MTA1、TAK1、TRAF6陽性表達的患者3年生存率低于陰性表達患者，提示三者在組織中表達情況能夠作為反映食管鱗癌患者預后的相關指標發(fā)揮作用。

MTA1得名于其基因表達水平能夠促進乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，其也在肝癌、喉癌、前列腺癌等腫瘤中表達異常升高，常預示患者預后不良的發(fā)生。王海清等[13]研究表明MTA1在子宮頸鱗癌組織中的表達水平明顯高于正常組織和上皮內(nèi)病變組織，且與腫瘤浸潤深度和腫瘤分期相關，MTA1高表達的宮頸癌患者常伴隨預后不佳。研究發(fā)現(xiàn)MTA1能夠通過Wnt通路和Akt通路調(diào)控腫瘤的生長，促進腫瘤細胞增殖和腫瘤微血管形成，還能夠通過調(diào)控CDK8水平加速腫瘤細胞周期的運行，增強腫瘤細胞的侵襲能力[14]，與本研究結(jié)果一致。TAK1是MAP3K家族成員之一，能夠被炎性因子激活參與腫瘤生長的調(diào)控，TAK1能夠激活NF-kB通路和MAPK通路介導多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。研究發(fā)現(xiàn)食管癌患者組織中TAK1及其下游蛋白TAB1水平異常升高，且高表達患者5年生存率明顯降低[16]。TAK1與TAB家族蛋白結(jié)合后能夠抑制細胞凋亡的作用，同時促進細胞周期的進行，促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移，特異性敲低TAK1表達水平后發(fā)現(xiàn)腫瘤凋亡增加，且腫瘤細胞發(fā)生G1/S期阻滯[17]，提示TAK1可能成為腫瘤治療的心靶點發(fā)揮作用。TRAF6/TAK1通路在機體免疫過程中發(fā)揮重要作用，通過激活NF-kB和MAPK通路介導白介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎性因子的表達，促進腫瘤的發(fā)生[18]。TRAF6還能夠促進AKT蛋白磷酸化和調(diào)控致癌基因Ras的表達促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，Ras作為TRAF6的下游靶點增強了腫瘤細胞的侵襲能力和生長能力，體外實驗敲除TRAF6后能夠阻止腫瘤細胞的生長和增殖[19]，但動物實驗表明完全抑制TRAF6的表達會導致胸腺萎縮和石骨癥的發(fā)生[20]，骨抑制TRAF6治療腫瘤疾病仍需進一步研究。

綜上所述，食管鱗癌組織中MTA1、TAK1、TRAF6陽性表達率高于癌旁組織，且三者表達情況與患者臨床病理特征和預后相關，可能作為食管鱗癌治療及預后評估的相關靶點發(fā)揮臨床作用。