劉志紅 孟令振 劉靜 魯明 王瑞英

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)占所有糖尿病的90%[1]，是胰島素抵抗和胰島素缺乏的結(jié)果，其中肝臟胰島素抵抗是T2DM發(fā)病機(jī)制的重要組成部分[2]。目前導(dǎo)致肝臟胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制仍有爭(zhēng)議，不同的假設(shè)將因果關(guān)系歸因于內(nèi)臟脂肪、脂肪因子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥等[3]。雖然肝臟胰島素抵抗的病理生理學(xué)是復(fù)雜和多因素的，但研究特定的分子機(jī)制可能為改善糖尿病肝臟胰島素抵抗提供新的治療策略。近年來，大量的基因芯片數(shù)據(jù)可以從公共數(shù)據(jù)儲(chǔ)存庫(kù)中免費(fèi)獲得，越來越多的研究者投入巨大的精力挖掘數(shù)據(jù)集中有價(jià)值的信息用于疾病的研究[4,5]，為糖尿病的診斷、治療提供新的生物標(biāo)志物。本研究通過生物信息學(xué)手段，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找到關(guān)于T2DM肝臟的基因芯片數(shù)據(jù)集同時(shí)結(jié)合CTD數(shù)據(jù)庫(kù)的IR相關(guān)基因，分析與肝臟IR差異表達(dá)基因(DEGs)及其通路，以期尋找到改善IR的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過檢索詞“type 2 diabetes”和“hepatic”在 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載數(shù)據(jù)集 GSE15653，該芯片數(shù)據(jù)由Pihlajam?ki等[6]于 2009年4月提交，以GPL96(HG-U133A)Affymetrix Human Genome U133A Array為研究平臺(tái)，分析4例2型糖尿病(GSM391707-GSM391710)及5例正常(GSM391693-GSM391697)肝臟組織的基因表達(dá)矩陣。

1.2 肝臟胰島素抵抗差異基因篩選與可視化 利用 GEO2R在線分析工具對(duì) GSE15653數(shù)據(jù)集樣本進(jìn)行分組并篩選出DEGs，以P值<0.01以及l(fā)ogFC絕對(duì)值≥1為篩選條件。使用ggplot2進(jìn)行差異基因的可視化[7]。同時(shí)從CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出36 787個(gè)肝臟IR相關(guān)基因，CTD數(shù)據(jù)庫(kù)[8]是研究人員為促進(jìn)了解環(huán)境化合物對(duì)人類健康的影響構(gòu)建的，為全世界的科研人員提供了集中、綜合的各種不同類型分子以及來自各種生物體的毒理學(xué)數(shù)據(jù)。應(yīng)用韋恩圖可視化兩基因集的交集基因IR-DEGs。

1.3 功能富集分析 使用R軟件包c(diǎn)lusterProfiler[9]對(duì)IR-DEGs進(jìn)行基因本體論(GO)分析和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)分析，同時(shí)以P<0.05為篩選條件。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及篩選關(guān)鍵基因 將上面得到的 IR-DEGs列表提交到 STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，設(shè)置最小連接評(píng)分為0.9構(gòu)建蛋白質(zhì)互相作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。使用 Cytoscape 3.8.0的 cytoHubba插件里的MCC算法篩選PPI網(wǎng)絡(luò)里排名靠前的 10個(gè)基因作為關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 肝臟胰島素抵抗差異基因 根據(jù)篩選條件，從GSE15653數(shù)據(jù)集篩選出1 233個(gè)DEGs。從CTD數(shù)據(jù)庫(kù)下載IR相關(guān)基因共36 786個(gè)基因，利用Vene與GSE15653的差異基因取交集后共得到1 197個(gè)IR-DEGs，其中在GSE15653上調(diào)IR-DEGs 352 個(gè)，下調(diào)DEGs 845個(gè)。見圖1。

圖1 DEGs 表達(dá)譜火山圖

2.2 GO 及KEGG 分析 將1 197個(gè)IR-DEGs進(jìn)行GO 富集分析，GO 富集分析由生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組成(CC)3個(gè)部分組成。根據(jù) P 值排序，KEGG 通路富集分析中，DEGs 富集于磷酸戊糖途徑、ErbB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路等。見表1、2，圖2。

圖2 IR-DEGs的KEGG分析

表1 KEGG 分析

表2 GO分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因 將1 197個(gè)DEGs提交到 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，形成PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape 軟件選取cytoHubb的MCC 算法得到10 個(gè)關(guān)鍵基因:MAPK3、SRC、MAPK8、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5。見圖3、4。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

胰島素抵抗是指胰島素的靶組織和細(xì)胞對(duì)其敏感性降低，是機(jī)體糖代謝紊亂的主要原因，因此對(duì)于T2DM的治療大多關(guān)注于如何改善IR，肝臟是胰島素在機(jī)體內(nèi)起作用的重要靶器官，調(diào)控糖原的合成和糖異生的進(jìn)程。肝臟IR將引起糖脂代謝紊亂以及其他病理過程的發(fā)生，因此本研究利用T2DM患者和正常人群肝臟組織樣本的基因數(shù)據(jù)集，通過 GEO2R鑒定與T2DM相關(guān)上調(diào)、下調(diào)DEGs，之后與CTD數(shù)據(jù)庫(kù)的IR基因取交集，得到1 197個(gè)肝臟IR-DEGs進(jìn)行分析，尋找治療肝臟IR的關(guān)鍵基因。

圖4 關(guān)鍵基因；節(jié)點(diǎn)顏色越深代表 MCC 分值越高

GO分析發(fā)現(xiàn)，肝臟IR-DEGs主要富集于類固醇激素反應(yīng)、Hsp90 蛋白結(jié)合、熱休克蛋白綁定等。類固醇激素中的糖皮質(zhì)激素可以導(dǎo)致肝臟IR增加[10]，體內(nèi)糖皮質(zhì)激素增加會(huì)升高乙酰輔酶A 羧化酶和脂肪酸合成酶的水平導(dǎo)致肝臟細(xì)胞脂質(zhì)變性和沉積，促進(jìn)炎性因子的釋放，阻礙胰島素信號(hào)通路，引起IR[11]。同時(shí)糖皮質(zhì)激素可以刺激磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶基因的表達(dá)，導(dǎo)致肝糖異生增加，加重IR。熱休克蛋白(HSPs)是一種伴侶蛋白，屬于幫助受損分子恢復(fù)其功能構(gòu)象的多肽家族。機(jī)體合成熱休克蛋白是為了應(yīng)對(duì)不同的應(yīng)激源(熱休克、低體溫、缺氧、自由基、缺血、乙醇、紫外線輻射、病毒感染等)刺激。熱休克蛋白通過減少氧化作用保護(hù)蛋白質(zhì)、脂類和核酸免受損害，因此具有細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)它們還調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和基因表達(dá)，并有助于蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。最重要的HSP家族有HSP40、HSP60、HSP70、HSP90-kDa，以及小的熱休克蛋白。研究發(fā)現(xiàn)DIO小鼠中的Hsp90β敲低可逆轉(zhuǎn)IR并改善葡萄糖耐量[12]，在糖尿病db/db小鼠模型中長(zhǎng)期使用HSP90抑制劑可抑制c-Jun氨基末端蛋白激酶1(JNK1)磷酸化逆轉(zhuǎn)高血糖癥，胰島素敏感性得到改善[13]。研究發(fā)現(xiàn)HSP70在糖尿病患者的血液循環(huán)中升高，并且與疾病的慢性程度呈正相關(guān)[14]。Krause等[15]認(rèn)為eHSP70/iHSP70比值可能是觸發(fā)導(dǎo)致IR和T2DM發(fā)展的慢性促炎狀態(tài)的決定性因素。但有研究發(fā)現(xiàn)HSP70對(duì)IR狀態(tài)有有益作用，能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷、炎癥和凋亡的損害[16]。Ohno等[17]也證實(shí)iHSP70 能夠改善IR、延緩甚至逆轉(zhuǎn)T2DM 疾病進(jìn)程，機(jī)制與阻斷JNKs抑制細(xì)胞凋亡而保護(hù)細(xì)胞相關(guān)。

KEGG分析中磷脂酰肌醇-3激酶(1-phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,Akt)通路是主要的胰島素信號(hào)通路[18]。胰島素與胰島素受體結(jié)合后激活胰島素受體底物(IRS)分子，IRS隨后與PI3K結(jié)合，磷酸化Akt 增加，活化的Akt一方面促使糖原合成酶激酶-3磷酸化[19]，加速肝糖原合成; 活化的 Akt同時(shí)激活Forkhead 轉(zhuǎn)錄因子 1的磷酸化，抑制肝糖異生關(guān)鍵酶的水平，降低肝糖異生[20]; 活化的Akt 也促進(jìn)葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶，加速肝臟葡萄糖的利用。在肝臟IR狀態(tài)時(shí),激活的IRS含量減少,PI3K活性下降,導(dǎo)致IRS/PI3K/Akt通路作用減弱,胰島素調(diào)節(jié)糖脂代謝的信號(hào)減弱,導(dǎo)致代謝紊亂，加重肝臟IR，形成惡性循環(huán)。因此胰島素信號(hào)通路在肝臟胰島素抵抗過程中起至關(guān)重要的作用。腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路在非胰島素依賴的葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用[21]，MAPK 通過磷酸化靶蛋白來調(diào)控信號(hào)通路，促進(jìn)脂肪酸氧化、抑制肝臟對(duì)糖的輸出、降低脂肪生成和三酰甘油的合成，從而發(fā)揮能量代謝。MAPK可通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體-4的表達(dá)，促進(jìn)糖的吸收和利用，增加胰島素受體的敏感性，改善IR[22]。

為了進(jìn)一步取得與肝臟IR相關(guān)度較高的關(guān)鍵基因，本研究應(yīng)用PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出MAPK3、SRC、MAPK8、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5這10個(gè)關(guān)鍵基因。SRC是一種原癌基因酪氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞增殖、分化等細(xì)胞過程中發(fā)揮作用。Feng等[23]發(fā)現(xiàn)棕櫚酸酯通過下調(diào)C2C12 肌管中SRC介導(dǎo)的Akt磷酸化導(dǎo)致IR。同時(shí)SRC1已被鑒定為核激素受體和其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，SRC1基因缺失增加DKO小鼠IRS1水平，從而引起葡萄糖攝取增加和改善胰島素敏感性，因此SRC1不僅是肥胖的潛在治療靶點(diǎn)，也是糖尿病的潛在治療靶點(diǎn)[24]。既往研究也發(fā)現(xiàn)氯沙坦通過上調(diào)SRC磷酸化水平，抑制對(duì)接蛋白1表達(dá)，增加Akt及其下游160 kDa Akt底物(AS160)的磷酸化水平，激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增加了葡萄糖攝取，改善棕櫚酸誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞IR[25]。MAPK8被稱為c-Jun NH2-terminal kinase 1(JNK1)，研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者中MAPK8 mRNA水平顯著升高[26]，參與肥胖誘導(dǎo)IR的機(jī)制，高脂肪飲食可導(dǎo)致小鼠JNK1信號(hào)通路激活、IR和肥胖[27]。

綜上所述，關(guān)鍵基因MAPK3、CCNB1、DLGAP5、ASPM、KRAS、NRAS、NUSAP1、BIRC5在肝臟IR中的作用尚不清楚，這些關(guān)鍵基因有可能成為肝臟IR早期診斷、治療的分子標(biāo)志物，尚需后續(xù)進(jìn)一步研究。