劉遠(yuǎn)航 張麗茹 仇永樂(lè) 劉昕 路月亭 胡燕

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)具有浸潤(rùn)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，其發(fā)病過(guò)程是由多種類(lèi)基因協(xié)同作用所致，并展現(xiàn)出多層次變化[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)介導(dǎo)基因調(diào)控和表達(dá)。研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA具有治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)的潛力，參與許多生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖、發(fā)育過(guò)程、炎性反應(yīng)等，包括癌癥在內(nèi)多種疾病均與其相關(guān)[2-4]。以往的研究注重于OSCC蛋白編碼基因，但最新研究顯示，lncRNA可能介導(dǎo)OSCC發(fā)病過(guò)程[5-15]。lncRNA PRNCR1作為miR-326“海綿”，上調(diào)FSCN1表達(dá)，從而促進(jìn)OSCC發(fā)展[6]。lncRNA ZEB1-AS1通過(guò)靶向下調(diào)miR-23a促進(jìn)OSCC，并能預(yù)測(cè)OSCC生存[7]。lncRNA PANDAR與SRSF7的結(jié)合上調(diào)了PIM1表達(dá)，從而促進(jìn)OSCC發(fā)展；而通過(guò)CRISPR-dCas9敲減lncRNA PANDAR能降低OSCC增殖和增加OSCC凋亡[8]。lncRNA LHFPL3-AS1作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)，通過(guò)靶向miR-362-5p/CHSY1通路促進(jìn)OSCC生長(zhǎng)和順鉑耐藥[9]。RBPJ過(guò)表達(dá)的巨噬細(xì)胞源性外泌體來(lái)源的lncRNA LBX1-AS1通過(guò)LBX1-AS1/miR-182-5p/FOXO3通路，抑制OSCC進(jìn)展[10]。LINC01303在OSCC組織中表達(dá)高于癌旁組織，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-429，上調(diào)ZEB1表達(dá)，從而促進(jìn)OSCC[11]。lncRNA NR2F2-AS1通過(guò)抑制miR-494的甲基化抑制OSCC細(xì)胞增殖[12]。lncRNA CEBPA-DT通過(guò)CEBPA/BCL2抑制OSCC細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)順鉑耐藥[13]。lncRNA HOXA-AS3通過(guò)海綿吸附miR-218-5p，從而促進(jìn)OSCC中癌細(xì)胞增殖[14]。lncRNA LINC00152與USF1的相互作用能夠增強(qiáng)USF1與MRPL52的啟動(dòng)子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，間接提高M(jìn)RPL52表達(dá)，從而促進(jìn)OSCC生長(zhǎng)[15]。本研究探討lncRNA在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2015年1月至2016年12月收集72例于石家莊市第二醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科手術(shù)切除的OSCC組織及對(duì)應(yīng)的正常組織(以距腫瘤邊緣>2 cm為標(biāo)準(zhǔn))，樣本切取后立刻存儲(chǔ)于-80℃。全部患者病理學(xué)診斷明確，病例資料完整，術(shù)前均未行放、化療等治療。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；RNeasy Mini Kit(德國(guó)Qiagen公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser RR047A、SYBR?Premix Ex TaqTM(大連寶生物TaKaRa公司)；PCR引物(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)公司)；SBC Human(4×180K)lncRNA芯片(上海伯豪生物公司)。

1.3 總RNA的提取與鑒定 取適量標(biāo)本組織，通過(guò)Trizol法提取總RNA；通過(guò)NanoDrop-2000超微量紫外分光光度計(jì)、Agilent Bioanalyzer 2100和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢，選取合格RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 cDNA合成、標(biāo)記與雜交 按照Low Input Quick Amp WT Labeling Kit(Agilent公司)及標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對(duì)合格總RNA進(jìn)行cDNA擴(kuò)增、熒光標(biāo)記、雜交。之后，洗滌雜交完成的芯片并進(jìn)行掃描。

1.5 芯片數(shù)據(jù)分析 選取3例口腔鱗癌及正常組織進(jìn)行芯片檢測(cè)，其中舌癌1例(T1N2M0)，牙齦癌1例(T2N0M0)，頰癌1例(T3N1M0)。芯片檢測(cè)可以覆蓋當(dāng)前的核心數(shù)據(jù)庫(kù)，如：GENCODE V21(7346)等。

1.6 數(shù)據(jù)提取及分析 使用安捷倫芯片掃描儀進(jìn)行芯片掃描，并通過(guò)安捷倫genespring GX V11通過(guò)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和分析。通過(guò)散點(diǎn)圖、熱圖顯示差異表達(dá)基因。通過(guò)差異表達(dá)基因Pearson系數(shù)篩選共表達(dá)基因，建立lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)差異表達(dá)lncRNA對(duì)應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO和Pathway富集分析，并預(yù)測(cè)差異表達(dá)lncRNA的靶基因。

1.7 qRT-PCR驗(yàn)證 取適量標(biāo)本組織，通過(guò)Trizol法提取總RNA，選取合格RNA逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，使用SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s。內(nèi)參為GAPDH，并采用2-△△Ct法測(cè)定RNA相對(duì)表達(dá)水平[5]。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)lncRNA和mRNA的數(shù)據(jù)分析 通過(guò)散點(diǎn)圖、分層聚類(lèi)分析，以差異倍數(shù)(fold change,FC)>2倍且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出顯著差異表達(dá)lncRNA和mRNA。芯片共篩選出2 294條差異表達(dá)lncRNA(933條上調(diào)lncRNA，1 361條下調(diào)lncRNA)，占所有可檢測(cè)lncRNA的2.9%；共篩選出1 938條差異表達(dá)mRNA(891條上調(diào)mRNA，1 047條下調(diào)mRNA)，占可檢測(cè)mRNA的10.3%。見(jiàn)表1～4。

表1 OSCC與正常組織相比表達(dá)上調(diào)的lncRNA(前15條)

表2 OSCC與正常組織相比表達(dá)下調(diào)的lncRNA(前15條)

表3 OSCC與正常組織相比表達(dá)上調(diào)的mRNA(前15條)

表4 OSCC與正常組織相比表達(dá)下調(diào)的mRNA(前15條)

2.2 lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖 通過(guò)構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)306條lncRNA與其他lncRNA或mRNA存在潛在相互作用。其中，lncRNA TMPRSS11BNL(關(guān)系度值22)和lnc-WRN-10∶1(關(guān)系度值21)是關(guān)系度最高的lncRNA，而其他無(wú)潛在直接作用的基因，也通過(guò)間接作用，與這兩條lncRNA發(fā)生相互作用。因此，lncRNA TMPRSS11BNL和lnc-WRN-10∶1可能是OSCC發(fā)病的節(jié)點(diǎn)基因。見(jiàn)圖1。

圖1 lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖；節(jié)點(diǎn)基因lncRNA TMPRSS11BNL和lnc-WRN-10∶1與其他基因潛在的相互作用圖；圓形代表mRNA，方形代表lncRNA；紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因

2.3 靶基因預(yù)測(cè) 通過(guò)cis和trans調(diào)控角度，預(yù)測(cè)差異表達(dá)lncRNA的靶基因。cis調(diào)控是對(duì)同一染色體上鄰近mRNA的轉(zhuǎn)錄激活及表達(dá)調(diào)控，而trans調(diào)控是對(duì)其他染色體上編碼基因的轉(zhuǎn)錄激活及表達(dá)調(diào)控。預(yù)測(cè)顯示，1 470條差異表達(dá)lncRNA含有潛在的cis或trans靶基因。其中，1 356條lncRNA可能與1 250條cis靶基因互作，370條lncRNA可能與2 454條trans靶基因互作，256條lncRNA可能同時(shí)與cis和trans靶基因互作。GO分析表明，MF靶基因主要富集在分子結(jié)合，比如“ion binding”和“anion binding”等。CC靶基因主要富集在細(xì)胞膜和細(xì)胞器，比如“organelle membrane”和“aggresome”等。BP靶基因主要在合成過(guò)程中富集，比如“organic substance biosynthetic process”和“cellular biosynthetic process”等。pathway分析表明，靶基因在43條pathway中顯著富集，其中占多數(shù)的是腫瘤相關(guān)pathway，但是靶基因也富集在“signal pathway”和“metabolism”等其他pathway中。見(jiàn)表5、6。

表5 GO富集度前10位的條目

2.4 GO和KEGG通路分析 基因本體論(gene ontology,GO)包括分子功能(molecular function，MF)、生物過(guò)程(biological process，BP)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)。與正常組織相比，OSCC組織上調(diào)表達(dá)基因中，601條基因與MF相關(guān)，599條基因與BP相關(guān)，638條基因與CC相關(guān)。MF富集度最高的是protein binding，BP富集度最高的是signal transduction，

表6 KEGG富集度前10位的條目

CC富集度最高的是cytoplasm。下調(diào)表達(dá)基因中，697條基因與MF相關(guān)，681條基因與BP相關(guān)，753條基因與CC相關(guān)。MF富集度最高的是calciumion binding，BP富集度最高的是oxidation-reduction process，CC富集度最高的是plasma membrane。KEGG分析表明，下調(diào)表達(dá)基因富集的通路183條，富集度最高的是Synthesis and degradation of ketone bodies。上調(diào)表達(dá)基因富集的通路157條，富集度最高的是Glycosaminoglycan biosynthesis。見(jiàn)圖2、3。

圖2 GO富集度前30位的條目；A 上調(diào)表達(dá)基因；B 下調(diào)表達(dá)基因

圖3 KEGG富集度前30位的條目；A 上調(diào)表達(dá)基因；B 下調(diào)表達(dá)基因

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證 隨機(jī)挑選10條差異表達(dá)lncRNA，在72例OSCC及對(duì)應(yīng)的正常組織中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，lnc-MANSC4-8∶1、CXCR2P1、NRIR、lnc-CMPK2-1∶3和lnc-GLI3-4∶1在OSCC中顯著上調(diào)，而TMPRSS11BNL、MEG3、lnc-WRN-10:1、DANCR和lnc-TPP2-7∶2在OSCC中顯著下調(diào)，這與芯片結(jié)果相一致。見(jiàn)表7、8。

表7 芯片數(shù)據(jù)與qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果間lncRNA差異倍數(shù)比較

3 討論

OSCC的早發(fā)現(xiàn)、早診治是癌癥研究人員的挑戰(zhàn)，而全面掌握OSCC發(fā)病分子機(jī)制是解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵[16]。研究證實(shí)，lncRNA介導(dǎo)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)能夠調(diào)控大量的編碼基因。此外，研究證實(shí)lncRNA與惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，但作用機(jī)制尚未完全明晰[17-19]。

本研究中，通過(guò)lncRNA表達(dá)譜芯片，我們篩選了OSCC中差異表達(dá)基因，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)(FC>2,P<0.05)，OSCC中共有2 294條差異表達(dá)lncRNA和1 938條差異表達(dá)mRNA。為驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取10條差異表達(dá)lncRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其結(jié)果與芯片相符合，說(shuō)明本研究篩選結(jié)果準(zhǔn)確而可靠。另外，還發(fā)現(xiàn)下調(diào)的lncRNA數(shù)量占明顯優(yōu)勢(shì)，暗示下調(diào)的lncRNA在OSCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮主導(dǎo)作用。

表8 72例OSCC和對(duì)應(yīng)的正常組織中l(wèi)ncRNA標(biāo)準(zhǔn)化水平比較

lncRNA轉(zhuǎn)錄模式復(fù)雜，能形成多種二級(jí)結(jié)構(gòu)，故僅基于其核酸序列預(yù)測(cè)其生物學(xué)功能存在局限性[20]。lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)表明lncRNA TMPRSS11BNL和lnc-WRN-10∶1與其他基因的關(guān)系度較高。因此，推測(cè)這兩條關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)lncRNA介導(dǎo)OSCC發(fā)病過(guò)程。通過(guò)lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，還發(fā)現(xiàn)lncRNA NR_002812作用于SP100和B2M等基因。研究表明，SP100蛋白與病毒感染、病毒相關(guān)蛋白互作和自身泛素化調(diào)節(jié)有關(guān)，同時(shí)，在干擾素和p53等多種pathway中發(fā)揮作用[21]。通過(guò)調(diào)控磷酸化AKT蛋白，p53蛋白抑制口腔惡性腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲[22,23]。lncRNA lnc-DHX37-5∶2和lnc-AHNAK2-9∶2可能會(huì)對(duì)S100 A8蛋白具有調(diào)控作用。研究表明，S100 A8蛋白通過(guò)Wnt/β-catenin通路參與口腔癌發(fā)生發(fā)展，并且在口腔癌，食道癌等癌癥中表達(dá)增加[24,25]。Wnt/β-catenin通路涉及眾多生物學(xué)過(guò)程，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。OSCC患者中β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高，重要的是，與OSCC患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[26]。另一方面，β-catenin通過(guò)作用Wnt通路中的靶點(diǎn)，使Wnt通路活化而調(diào)節(jié)下游靶蛋白C-myc和Cyclin D在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況[27]。另外，細(xì)胞周期蛋白CCND3與本實(shí)驗(yàn)篩選出的lncRNA ENST00000583044、NR_104048、NR_ 120366和lnc-WRN-10∶1等均有潛在的相互作用。CCND3表達(dá)下調(diào)能夠提高OSCC對(duì)順鉑的敏感性，說(shuō)明上述4條lncRNA都可能通過(guò)CCND3介導(dǎo)OSCC發(fā)病過(guò)程。綜上，lncRNA可能通過(guò)直接或者間接調(diào)節(jié)癌癥蛋白編碼基因，從而調(diào)控OSCC發(fā)生發(fā)展。

通過(guò)GO和KEGG通路分析，探討lncRNA對(duì)OSCC潛在的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)mRNA顯著富集在多種MF、BP和CC中，并且顯著富集在多條與癌癥相關(guān)的通路，例如，“Small cell lung cancer”、“Thyroid cancer”、“Bladder cancer”、“Glycerolipid metabolism”等。這些結(jié)果表明，OSCC發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、代謝失調(diào)、癌基因及抑癌基因異常等生物學(xué)過(guò)程密不可分。本研究中，還通過(guò)cis和trans調(diào)控兩種角度，預(yù)測(cè)差異表達(dá)lncRNA的靶基因。cis和trans靶基因的GO和pathway分析表明OSCC發(fā)生發(fā)展與“細(xì)胞器官、合成代謝”等GO term及“癌癥”等pathway密切相關(guān)。

在本研究中，篩選出的差異表達(dá)lncRNA在OSCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制尚待研究證實(shí)。然而，我們的lncRNA數(shù)據(jù)及其潛在的靶基因數(shù)據(jù)，為深入研究lncRNA調(diào)控OSCC發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制提供了重要的線索，為OSCC診斷與治療提供新的思路。