吳璐瑤，張 卓，孔 曉，金德才，高丹蕾，袁 濤

(1 北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，國家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083；2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，湖南 長沙 410128；3 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南省植物保護研究所，湖南省園藝作物病蟲害防治重點實驗室，湖南長沙410125；4 青島大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島266021；5 中國科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，北京100085)

大葉黃楊(Euonymusjaponicus)為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬常綠灌木，又名冬青衛(wèi)矛、日本衛(wèi)矛等，其分布廣、抗性強、耐修剪、易繁殖，是園林中常用的綠籬樹種。大葉黃楊白粉病是大葉黃楊主要真菌病害之一，近年來發(fā)生比較普遍，部分地區(qū)病葉率高達38%[1]。大葉黃楊白粉病病原菌是白粉菌科的Erysiphealphitoides[2-3]，它常寄生在枝葉表面形成白色粉末狀病斑，嚴(yán)重時導(dǎo)致病葉卷曲、皺縮，枝梢扭曲變形，極大影響大葉黃楊的健康生長及景觀效果。目前大葉黃楊白粉病的主要防治手段是采用殺菌劑及栽培管理。杜津釗等[4]評價了15種殺菌劑對大葉黃楊白粉病的藥效；劉興元[5]提出通過加強栽培管理，控制栽植密度增強樹勢，結(jié)合修剪整形及時除去病葉、病梢等提高大葉黃楊的抗病力。針對大葉黃楊白粉病生物防治的相關(guān)研究尚未見報道，因此大葉黃楊葉內(nèi)生細菌群落對白粉病感染的響應(yīng)效應(yīng)值得深入研究。

植物內(nèi)生菌是指生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各個組織，不引起宿主植物明顯病害癥狀，與植物互利共生的真菌或細菌[6-7]。葉內(nèi)生菌與葉表附生微生物一起被稱為葉圈微生物[8-9]，其與植物光合和蒸騰作用及葉部病害息息相關(guān)，是植物生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[10]。植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)可以增強宿主植物的抗病性。Arnold等[11]發(fā)現(xiàn)，可可豆(Theobromacacao)幼苗受到疫霉屬(Phytophthorasp.)病菌侵襲時，將從自然感染的無癥狀寄主中分離的內(nèi)生菌接種無內(nèi)生菌的葉片可以顯著降低葉片死亡率。有研究發(fā)現(xiàn)，從中國南海紅樹中分離的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生抑制酵母菌和霉菌灰的黃霉素A和多種醌類抗生素[12]；從大戟(Euphorbiapekinensis)新鮮葉片中分離得到的鐮刀菌E5能使宿主對枯草桿菌(Bacillussubtilis)、輪梗霉、裂殖酵母及腐霉產(chǎn)生拮抗作用[13]。

在植物內(nèi)生菌研究中，傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法受不可培養(yǎng)的內(nèi)生菌的限制，而高通量測序技術(shù)成本低廉、覆蓋度深，近年來得到廣泛應(yīng)用。如Kumaresan等[14]借助高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，紅樹(Rhizophoraapiculata)隨著葉齡的增加內(nèi)生菌豐富度呈增加趨勢，且某些內(nèi)生菌在凋落物降解中有重要作用。本研究采集北京市綠化帶內(nèi)大葉黃楊健康葉片與白粉病葉片，利用Illumina MiSeq測序技術(shù)分析大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落特征及其互作關(guān)系，確定群落的關(guān)鍵種，以探究大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落對白粉病入侵的響應(yīng)情況。

1 材料與方法

1.1 葉片采集

2017年12月，從北京市海淀區(qū)林大北路中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心西門大葉黃楊綠化帶5 m×1 m區(qū)域內(nèi)分別采集大葉黃楊健康葉片(healthy leaves，HL)和感染白粉病葉片(diseased leaves,DL)各90片，每組葉片隨機分成9個重復(fù)，每個重復(fù)10片。DL白色病斑面積超過葉面積50%，HL無病斑。采集的葉片一部分保存于4 ℃冰箱用于葉片理化性質(zhì)的測定，另一部分保存于-80 ℃冰箱用于檢測內(nèi)生細菌種類。

1.2 大葉黃楊葉片理化成分的測定

采用水楊酸比色法[15]測定葉片硝酸鹽含量，采用蒽酮比色法[16]測定葉片可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍G250染色法[17]測定葉片可溶性蛋白質(zhì)含量，采用丙酮萃取法[18]測定葉片葉綠素含量。

1.3 大葉黃楊葉片內(nèi)生菌16S rRNA 的PCR擴增和Illumina測序

將HL、DL用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡10 min，25 g/L NaClO溶液浸泡10 min，無菌水清洗5次，以防止葉片表面的微生物影響測量結(jié)果。使用Fast DNA Spin Kit for Soil (MP Biomedals,Santa Ana,USA)提取葉片總DNA。采用通用引物799F(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′)和1115R(5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′)，對細菌16S rRNA基因的V5-V6高變區(qū)進行PCR擴增，以避免葉綠體DNA的擴增[19]。PCR擴增體系：10×PCR緩沖液5 μL，dNTPs 4 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL(北京TaKaRa生物科技公司)，上下游引物各1.5 μL(10 μmol/L)，DNA模板1 μL(20～30 ng/μL)，超純水補至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性20 s，57 ℃退火25 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物(電泳條件：110 V,300 mA)，使用E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,USA) 試劑盒純化16S rRNA。用Qubit hs-DS-DNA kit (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)試劑盒在Tecan Infinit F200 Pro平板閱讀器上對純化的16S rRNA擴增產(chǎn)物進行定量。所有PCR擴增片段等量混合(每樣品150 ng)后，用上海生物制藥科技有限公司Illumina MiSeq(2×250)測序儀(Illumina,Inc.,San Diego,CA,USA)測序。將16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)提交至Galaxy平臺(http://mem.rcees.ac.cn:8080)。首先，按照標(biāo)簽將原始數(shù)據(jù)中的不同樣品區(qū)分，去掉標(biāo)簽和引物序列，使用FLASH合并相同序列的上、下游引物[20]。然后用Btrim過濾序列，保留平均質(zhì)量得分大于20的序列，刪除帶有簡并堿基以及長度小于200 bp的序列[21]。最后用UPARSE去除序列中的嵌合體[22]，同時以97%的相似度閾值將序列聚類成可操作的分類單元(operational taxonomic units,OTU)，并利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目16S分類器將16S rRNA基因代表性序列分類注釋[23]。

1.4 統(tǒng)計分析

大葉黃楊葉片內(nèi)生菌細菌群落多樣性及優(yōu)勢門、屬相對豐度與葉片理化性質(zhì)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析法和t檢驗進行。細菌群落豐富度(observed species richness,Sobs)和多樣性指數(shù)(香濃指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)和Chao1)用R軟件VEGAN進行分析。

使用Jaccard、Bray-Curtis距離矩陣表示細菌群落結(jié)構(gòu)，其不相似性分析采用ADONIS、MRPP和PERMANOVA方法進行。使用R軟件VEGAN進行典范對應(yīng)分析(canonical correspondence analusis,CCA)和Mantel分析。

通過在線平臺(http://ieg2.ou.edu/MENA)構(gòu)建大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)[24]，結(jié)果通過Gephi0.9.2實現(xiàn)可視化?；陔S機矩陣?yán)碚?random matrix theory,RMT)進行網(wǎng)絡(luò)拓撲特征、網(wǎng)絡(luò)互作和模塊節(jié)點拓撲角色識別。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉黃楊葉片的理化成分

由表1可以看出，與HL相比，DL的葉綠素和硝酸鹽含量下降，而可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量增加，其中葉綠素和可溶性蛋白質(zhì)含量差異顯著。

表1 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)的理化成分含量Table 1 Physicochemical properties content in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

2.2 大葉黃楊葉片的內(nèi)生細菌群落特征

經(jīng)質(zhì)量篩選、嵌合體檢測和非靶標(biāo)生物剔除，從大葉黃楊HL與DL的18個樣本共獲得高質(zhì)量細菌16S rRNA基因序列1 981 980條，每個樣本獲得16S rRNA基因序列介于10 257～840 990條。由于樣本間序列差異較大，將所有樣本隨機重新抽樣到相同的測序深度(10 257個序列)，重抽后所有樣本序列被聚類為1 931個OTU，每個樣本的細菌OTU數(shù)量在76～318個，平均為172個。大葉黃楊HL和DL內(nèi)生細菌群落OTU組成無顯著差異(P=0.952)。對大葉黃楊HL和DL的Sobs和Shannon、Simpson、Chao1多樣性指數(shù)進行比較，結(jié)果見表2。由表2可以看出，根據(jù)Sobs值， HL的細菌群落多樣性稍低于DL；而根據(jù)Shannon、Simpson和Chao1多樣性指數(shù)，HL的細菌群落多樣性稍高于DL，但差異均不顯著。

表2 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)的內(nèi)生細菌群落多樣性Table 2 Endophytic bacterial communities diversity in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

將DL和HL的內(nèi)生細菌群落多樣性與葉片理化性質(zhì)進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果(表3)表明，HL的硝酸鹽含量與葉內(nèi)生細菌群落的Chao1指數(shù)呈顯著負相關(guān)，而DL的硝酸鹽含量與葉內(nèi)生細菌群落的Simpson指數(shù)呈顯著正相關(guān)。HL和DL的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量與葉內(nèi)生細菌群落多樣性的相關(guān)性均未達顯著水平。

表3 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細菌群落多樣性與葉片理化成分的相關(guān)性Table 3 Correlation analysis of endophytic bacterial communities diversity and physicochemical properties in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

2.3 大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)

HL和DL內(nèi)生細菌群落在門水平上的分布如圖1-A所示。由圖1-A可以看出，HL的優(yōu)勢門為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍細菌門(Cyanobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，其相對豐度分別為70.93%，14.87%，9.55%，1.38%和2.58%；DL的優(yōu)勢門為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和藍細菌門，其相對豐度分別為74.20%，12.15%，4.82%和7.33%。兩組樣本中，變形菌門的相對豐度均最高，其次為放線菌門。HL的放線菌門、厚壁菌門與擬桿菌門占比稍高于DL，而DL細菌群落中的藍細菌門相對豐度顯著高于HL。

相對豐度≤1%的門和屬被歸類為“其他”Phylum and genus with relative abundance less than 1% were classified as “Others”圖1 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細菌在門(A)和屬(B)水平上的群落組成Fig.1 Community composition of endophytic bacteria of Euonymus japonicas healthy leaves (HL) and powdery mildes leaves (DL) at phylum (A) and genus (B) levels

由圖1-B可知，在屬水平上，HL內(nèi)生細菌群落的分布與DL差別較大。HL優(yōu)勢屬為羅爾斯通氏菌屬、無色桿菌屬、貪銅菌屬、類芽孢桿菌屬、鹽孢菌屬、芽孢桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、土單胞菌屬和節(jié)桿菌屬，其相對豐度分別為8.40%，5.42%，5.06%，4.88%，3.98%，2.91%，2.12%，1.97%和1.35%；DL優(yōu)勢屬為羅爾斯通氏菌屬、鹽孢菌屬、伯克霍爾德菌屬、芽孢桿菌屬和羅河桿菌屬，其相對豐度分別為13.69%，6.09%，3.16%，1.32%，1.27%。大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落中未分類細菌占比最大，羅爾斯通氏菌屬為葉內(nèi)最常見屬。HL的無色桿菌屬、貪銅菌屬、類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬、土單胞菌屬、節(jié)桿菌屬的相對豐度大于DL。DL的羅爾斯通氏菌屬、鹽孢菌屬、伯克霍爾德菌屬和羅河桿菌屬的相對豐度高于HL。

HL和DL內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)的不相似性結(jié)果表明，兩者的群落結(jié)構(gòu)無顯著差別。

2.4 大葉黃楊葉片理化成分與葉片內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系

用典范對應(yīng)分析(CCA)來評估大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)與葉片理化性質(zhì)之間的可能聯(lián)系，結(jié)果見圖2。

圖2 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細菌群落與葉片理化特性的CCA分析Fig.2 CCA analysis of endophytic bacterial community and physicochemical properties of Euonymus japonicas healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL)

圖2表明，大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落的CCA模型是顯著的(F=1.531,P=0.032)，兩個軸(CCA1、CCA2)對大葉黃楊內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)的解釋率合計為23.62%。第一軸(CCA1)與大葉黃楊葉片的葉綠素含量呈顯著正相關(guān)(P=0.002)，與硝酸鹽含量、可溶性糖含量呈正相關(guān)，而與可溶性蛋白質(zhì)含量呈負相關(guān)。CCA-VPA結(jié)果表明，大葉黃楊葉片的葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、硝酸鹽含量4個理化特性共解釋39.39%的內(nèi)生細菌群落變化，解釋量分別為20.02%，12.856%，10.37%和8.37%。Mantel分析結(jié)果(表4)進一步證實，大葉黃楊葉片的葉綠素含量顯著影響內(nèi)生細菌群落的豐度，而硝酸鹽、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量對細菌群落結(jié)構(gòu)無顯著影響。

表4 大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)與葉片理化成分的Mantel分析Table 4 Mantel analysis of endophytic bacterial community structure and physicochemical properties of Euonymus japonicas leaves

相關(guān)性分析結(jié)果(表5)顯示，HL的葉綠素含量與變形菌門相對豐度呈極顯著負相關(guān)，而與放線菌門呈極顯著正相關(guān)，硝酸鹽含量與藍細菌門呈極顯著負相關(guān)。DL的理化性質(zhì)與細菌群落優(yōu)勢門的分布無顯著相關(guān)性。

表5 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細菌群落4個優(yōu)勢門相對豐度與葉片理化成分的相關(guān)性Table 5 Correlation analysis between relative abundance of 4 endophytic bacterial dominant phyla and physicochemical properties in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

由表6可以看出，HL的可溶性糖含量與羅爾斯通氏菌屬、鹽孢菌屬、伯克霍爾德菌屬、羅河桿菌屬相對豐度呈顯著或極顯著負相關(guān)，可溶性蛋白質(zhì)含量與芽孢桿菌屬呈顯著正相關(guān)，葉綠素含量與貪銅菌屬、類芽孢桿菌屬、土單胞菌屬、節(jié)桿菌屬的相對豐度呈極顯著正相關(guān)。DL的硝酸鹽含量與芽孢桿菌屬呈極顯著正相關(guān)，其他理化指標(biāo)與細菌群落優(yōu)勢屬的分布無顯著相關(guān)性。

2.5 大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)能夠反映不同微生物種間的互作關(guān)系，從而可識別微生物群落中的關(guān)鍵物種，對于篩選具有抵御病菌作用的微生物具有很高的參考價值。本研究篩選并保留在50%樣本中同時出現(xiàn)的OTU，在相同的相似度閾值水平(0.94)比較HL與DL內(nèi)生細菌群落的拓撲性質(zhì)。結(jié)果(表7)顯示，HL和DL內(nèi)生細菌群落的網(wǎng)絡(luò)連接性分布符合冪律模型(power-law module)。HL與DL內(nèi)生細菌網(wǎng)絡(luò)與其對應(yīng)的隨機網(wǎng)絡(luò)的聚類系數(shù)、平均距離和模塊化值差異極顯著，表明網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并非隨機無序構(gòu)建，其相互連接具有顯著的確定性意義。將兩個細菌互作網(wǎng)絡(luò)可視化，結(jié)果(圖3)表明，DL的內(nèi)生細菌平均連接性要高于HL，且細菌網(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜。HL中厚壁菌門、變形菌門與其他細菌聯(lián)系較為密切，DL中變形菌門和放線菌門與其他細菌聯(lián)系更密切。HL、DL大部分細菌之間的互作關(guān)系是負向的，負相關(guān)關(guān)系占比分別為68.46%和71.43%，表明不同細菌之間多為相互競爭關(guān)系，且白粉病感染加劇了細菌間的競爭。

表6 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細菌群落10個優(yōu)勢屬相對豐度與葉片理化指標(biāo)的相關(guān)性Table 6 Correlation analysis between relative abundance of 10 endophytic bacterial dominant genera and physicochemical properties of Euonymus japonicas’s healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL)

表7 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細菌實證分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的拓撲特性與隨機網(wǎng)絡(luò)比較Table 7 Comparison of topological characteristics between empirical molecular ecological network and random network of endophytic bacteria in healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL) of Euonymus japonicas

分子網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點都具有不同的拓撲角色，根據(jù)節(jié)點的模塊內(nèi)連通性(Pi)和模塊間連通性值(Zi)將節(jié)點區(qū)分為外圍節(jié)點(peripherais)、連接節(jié)點(connectors)、模塊中心點(module hubs)和網(wǎng)絡(luò)中心點(network hubs)4類(圖4)，其中連接節(jié)點、模塊中心點、網(wǎng)絡(luò)中心點可作為群落關(guān)鍵種[25]。從圖4可以看出，HL和DL細菌網(wǎng)絡(luò)中的大多數(shù)節(jié)點都是外圍節(jié)點，且均無網(wǎng)絡(luò)中心點；僅DL細菌網(wǎng)絡(luò)有模塊中心點和連接節(jié)點，模塊中心點為OTU_722(放線菌門諾卡氏菌科紅球菌屬)，連接節(jié)點為OTU_142(變形菌門生絲微菌科生絲微菌屬)、OTU_90(變形菌門華桿菌科)、OTU_128(放線菌門類諾卡氏菌科)、OTU_80 (放線菌門魚孢菌科)。關(guān)鍵種的變化表明，大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落對白粉病有響應(yīng)效應(yīng)。

一個節(jié)點(node)代表一個OTU；節(jié)點顏色代表門水平的不同分類，節(jié)點大小代表其連接數(shù)；每條邊分別表示由其連接的兩個節(jié)點之間的相關(guān)性，橙色線代表負相關(guān)關(guān)系，藍色線代表正相關(guān)關(guān)系A(chǔ) node represents an OTU.The color of nodes represents the different classification of gate level,and the size of nodes represents the number of connections.Each edge represents the correlation between the two nodes.The orange line represents the negative correlation, while the blue line represents the positive correlation圖3 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細菌群落的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Interaction of endophytic bacterial community networks in Euonymus japonicas healthy leaves (HL) and powdery mildew leaves (DL)

節(jié)點1～4分別代表OTU_80、OTU_128、OTU_90和OTU_142Nodes 1-4 represent OTU_80,OTU_128,OTU_90,OTU_142圖4 大葉黃楊健康葉片(HL)和白粉病葉片(DL)內(nèi)生細菌模塊節(jié)點的拓撲角色分布Fig.4 Endophtic bacterial module node topology role distribution of Euonymus japonicas healthy leaves (HL) and powdery mildes leaves (DL)

3 討 論

內(nèi)生菌在植物根、莖、葉、花和果實的細胞或細胞間隙中普遍存在，它們與植物的關(guān)系可能比葉表面的微生物更密切。國內(nèi)外研究表明，植物體內(nèi)分離的某些微生物對病原菌有拮抗作用，可增強植物的抗病性[10-11,14]。因此植物內(nèi)生菌的研究有助于葉部病害的生物防治。

本研究結(jié)果顯示，大葉黃楊葉片內(nèi)生細菌群落中，變形菌門占絕對優(yōu)勢，這與鄧平香等[26]、Fernando等[27]、Natacha等[28]對東南景天(Sedumalfredii)、番茄(Solanumlycopersicum)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)內(nèi)生細菌的研究結(jié)果一致。人們對水稻(Oryzasativa)[29]、楊樹(PopulustremulaxPopulusalba)[30]、甜葉菊(Steviarebaudiana)[31]以及一些非栽培植物[32]內(nèi)生細菌的研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌屬、芽孢桿菌屬、羅爾斯通氏菌屬、伯克霍爾德菌屬、節(jié)桿菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)是植物葉內(nèi)生菌中的常見屬。本研究中除了假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和甲基桿菌屬未發(fā)現(xiàn)外，其余葉片內(nèi)生細菌群落優(yōu)勢屬均出現(xiàn)。另外，本研究在大葉黃楊葉片中檢測到的貪銅菌屬、無色桿菌屬、鹽孢菌屬、土單胞菌屬細菌在其他植物葉內(nèi)生菌研究中尚未見報道，這可能與本研究大葉黃楊葉片采集地的環(huán)境相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，北京城區(qū)交通干道附近綠化帶重金屬含量超過北京土壤背景值[33]，并且大葉黃楊葉表也具有吸附空氣中鋁、銅、鋅、砷和鎘等重金屬元素的能力[34]。因此具有重金屬耐受性與修復(fù)性的貪銅菌屬微生物[35-36]以及其他屬微生物得以在葉內(nèi)富集。

研究表明，一些病菌感染宿主植物后會降低植物內(nèi)生菌的多樣性[37-38]，但也有研究表明，病菌感染對宿主植物內(nèi)生細菌群落的豐富度無顯著影響[39-40]。還有研究認(rèn)為，病菌感染可能會提高宿主植物內(nèi)生菌的豐富度，如感染白葉枯病后，水稻葉片內(nèi)生細菌群落多樣性增大[41]。本研究中，大葉黃楊健康葉片與染病葉片細菌群落差異很小；Shannon、Simpson及Chao1值表明，健康葉片的細菌群落多樣性稍高于白粉病感染的葉片，但差異不顯著?？梢娫诓煌瑮l件下，病菌對宿主植物內(nèi)生細菌群落多樣性的影響及兩者的互作關(guān)系仍需進一步研究。

大量研究證實，葉齡[9]、CO2濃度[8]、溫度[42]等均會影響葉內(nèi)生菌群落，但關(guān)于葉綠素含量等葉片理化性質(zhì)對微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究較少。本研究結(jié)果表明，大葉黃楊葉片葉綠素含量與葉內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)呈顯著正相關(guān)，主要影響健康葉片變形菌門與放線菌門的相對豐度，這與Martin等[43]對歐洲山毛櫸(Fagussylvatica)的研究結(jié)果一致。大葉黃楊葉片是發(fā)揮園林景觀價值和生態(tài)效益的重要器官，葉綠素含量與細菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系有待今后深入研究。

本研究中，感染白粉病后大葉黃楊葉內(nèi)生細菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜，這與前人研究結(jié)果相似。Hu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，相較于健康植株，青枯病侵染的煙草(Nicotianatabacum)根內(nèi)生細菌群落具有更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和更多的相互作用關(guān)系。Víctor等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中接種病原菌后甜菜根內(nèi)生菌網(wǎng)絡(luò)連接性變得更高。此外，大葉黃楊白粉病削弱了厚壁菌門與其他細菌的聯(lián)系，加強了放線菌門和變形菌門與其他微生物的聯(lián)系，放線菌門諾卡氏菌科紅球菌屬、類諾卡氏菌科和魚孢菌科及變形菌門生絲微菌科生絲微菌屬和華桿菌科是葉內(nèi)生細菌群落的關(guān)鍵種。關(guān)鍵種的變化表明，大葉黃楊白粉病葉片內(nèi)生細菌群落中的關(guān)鍵種與白粉病菌入侵關(guān)系密切，可能通過分泌抗菌類物質(zhì)或與病原菌爭奪生態(tài)位等來抵御白粉病[10-11,14]。今后可分離內(nèi)生細菌群落的關(guān)鍵種,并探究其在白粉病感染中的作用，這對大葉黃楊白粉病生物防治具有重要意義。