賈文飛，魏曉瓊，聶小蘭，王 穎，李金英，吳 林

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，吉林 長春 130118；2 吉林省藍莓研究中心，吉林 長春 130021)

越橘俗稱藍莓(blueberry)，是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)多年生落葉常綠灌木或小灌木，世界性小漿果樹種，因果實具有獨特的營養(yǎng)保健價值，近年來在國內(nèi)外市場引起廣泛的關(guān)注[1-3]。中國是潛在的越橘生產(chǎn)大國，自20世紀80年代引進越橘，經(jīng)過幾十年的推廣，種植面積已經(jīng)達到6.64×104hm2[4-5]。土壤鹽堿化是全球性環(huán)境問題，是影響農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一，世界鹽堿地約9.5億hm2，相當于全球陸地總面積的7.23%[6-7]，而我國鹽漬化面積達3.6×107hm2[8]，嚴重影響國內(nèi)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，并且由于人類活動和氣候變化的影響，土壤鹽堿化趨勢逐年加劇。國內(nèi)多個越橘種植地均存在不同程度的土壤鹽堿問題，其中越橘的主產(chǎn)區(qū)之一松嫩平原就是世界三大鹽堿地之一，該地區(qū)鹽堿化問題主要是由Na2CO3和NaHCO3引起的。

土壤鹽堿化是影響植物生長的非生物因素之一，土壤中鹽分過高會影響植物正常生長，常造成離子毒害、膜損傷、活性氧傷害、養(yǎng)分虧缺、生物量減少、光合作用減弱，耗能增加[9-10]，表現(xiàn)為葉片失綠、植株矮小、根部生長受抑。植物受到鹽堿環(huán)境脅迫時會通過調(diào)整自身生理生化反應來適應，會從形態(tài)結(jié)構(gòu)、原生質(zhì)膜選擇性吸收或排斥離子、提高植株體內(nèi)水分含量、細胞滲透調(diào)節(jié)與滲透保護、離子平衡或離子區(qū)域化、活性氧清除等方面提高自身耐鹽堿性[11-13]。

土壤鹽堿化是目前影響越橘發(fā)展的主要限制因素之一，前人對越橘耐鹽堿性研究多集中在NaCl等中性鹽上[14-16]，而對堿性鹽和復合鹽脅迫下越橘形態(tài)生理指標的變化鮮有研究報道。本研究采用盆栽試驗，從葉片形態(tài)、葉綠素含量、生理生化變化、解剖結(jié)構(gòu)等方面探究越橘‘北陸’對復合鹽和堿性鹽環(huán)境的適應能力，旨在探明越橘的抗鹽堿生理，為其在廣大偏鹽堿地區(qū)的種植提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2年生半高叢越橘‘北陸’，由吉林省長春市普藍高科技有限公司靖宇基地提供。

1.2 試驗方法

盆栽試驗在吉林農(nóng)業(yè)大學(E120°24′，N43°48′)越橘產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)新科研實踐基地日光溫室內(nèi)進行。2020年5月，選取生長狀況一致、無任何機械損傷和病蟲害的越橘苗移栽到花盆中(盆高 30 cm、口徑35 cm、底徑25 cm)進行緩苗，每盆1株，栽培基質(zhì)由園土和草炭二者按體積比1∶1混合而成(pH為4.8)。緩苗期共60 d。

2020年7月進行正式試驗，試驗采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計，在1/10改良Hoagland營養(yǎng)液(pH 4.8)[17]中添加不同濃度的NaCl、Na2CO3、NaHCO3進行鹽堿脅迫處理，試驗設(shè)復合鹽(NaCl+Na2CO3)處理(A)、堿性鹽(NaHCO3+Na2CO3)處理(B)兩大類，A、B類處理分別設(shè)A1～A6、B1～B6處理，具體見表1。以僅澆灌1/10改良Hoagland 營養(yǎng)液的處理為對照(CK)。每處理3次重復，每重復3盆，共計117株越橘。

表1 不同鹽堿脅迫處理的組成及溶液pH值Table 1 Composition and solution pH of different saline-alkali stress treatments

試驗開始每盆越橘澆灌500 mL處理液(1/10改良Hoagland營養(yǎng)液與不同濃度鹽堿的混合液)，為避免鹽沖擊將500 mL處理液分5次澆灌，每天澆灌100 mL，共澆灌5 d，若盆底托盤有溶液滲出，滲出液倒回原盆內(nèi)，最后一次澆灌后的第2天記為處理1 d，每天18:00-19:00用稱重法澆灌蒸餾水以彌補蒸發(fā)掉的水分。第30天，選取植株第3～5片成熟功能葉，用蒸餾水清洗干凈后用濾紙擦拭表皮水分，置于密封袋中帶回實驗室，待測。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 葉片形態(tài) 鹽堿脅迫處理30 d后，每個處理隨機選取3片同一部位成熟功能葉，進行葉片形態(tài)觀察。

1.3.2 葉片葉綠素含量和抗氧化生理指標 葉綠素a、b(chl a、chl b)含量采用乙醇-丙酮混合液浸泡法[18]測定，細胞膜透性(cell membrane permeability,CMP)采用電導法[18]測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光還原法[19]測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[19]測定，可溶性糖(soluble sugar,SS)含量采用蒽酮法[19]測定，可溶性蛋白(soluble protein,SP)含量采用考馬斯亮藍法[19]測定，脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮比色法[19]測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法[19]測定。

1.3.3 葉片解剖結(jié)構(gòu) 試驗30 d后，在每個處理中隨機取6片同一部位成熟功能葉，去掉葉柄，沿主脈將其剪成1 cm×1 cm小方塊，放入FAA固定液中固定，使用真空抽濾器抽氣20 min，采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)制片[20]，使用番紅-固綠染色，中性樹膠封固，制成永久封片，并在35 ℃恒溫保存。用Panthera i生物顯微鏡觀察并拍照，利用Motic Images Plus 3.0(×64)軟件測量葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄薄壁組織厚度、海綿薄壁組織厚度和中脈厚度，并計算葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度 (cell tense ratio,CTR) 、葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度(vein protuberant degree,SR)與柵/海(P/S):CTR=柵欄薄壁組織厚度/葉片厚度×100%，SR=海綿薄壁組織厚度/葉片厚度×100%，柵/海=柵欄薄壁組織厚度/海綿薄壁組織厚度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和相關(guān)性分析，并用Duncan’s新復極差法檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對越橘葉片形態(tài)的影響

由圖1和表2可知，在復合鹽處理(A類處理)中，當鹽濃度為30～60 mmol/L時，越橘葉片形態(tài)正常；之后隨著鹽濃度的增加，葉片開始失綠變黃，最終出現(xiàn)落葉。在堿性鹽處理(B類處理)中，當鹽濃度為30 mmol/L時，越橘葉片形態(tài)正常；之后隨著鹽濃度的增加，葉片開始失綠，出現(xiàn)紅褐色斑塊，最終干枯，出現(xiàn)落葉。可知在高濃度復合鹽和堿性鹽脅迫下，越橘葉片均表現(xiàn)出了明顯的鹽害癥狀，且堿性鹽脅迫處理葉片的鹽害癥狀更明顯。

圖1 不同鹽堿脅迫下越橘‘北陸’葉片形態(tài)的變化Fig.1 Leaf morphology of ‘Northland’ blueberry under different saline-alkali stress treatments

表2 不同鹽堿脅迫對越橘‘北陸’葉片形態(tài)特征的影響Table 2 Effects of different saline-alkali stress treatments on morphological characteristics of leaves of ‘Northland’ blueberry

2.2 鹽堿脅迫對越橘葉片葉綠素含量的影響

如表3所示，在復合鹽和堿性鹽處理中，隨著鹽濃度的增加，越橘葉片葉綠素含量均呈降低趨勢。在A類處理中，除了A1處理外，其他處理的Chl a、Chl(a+b)含量與CK差異顯著(P<0.05)；除A1、A2處理外，其他處理的Chl b含量與CK差異顯著(P<0.05)。 B類處理中，除B1處理外，其他處理的Chl b、Chl(a+b)與CK差異顯著(P<0.05)；B1～B6的Chl a含量均與CK差異顯著(P<0.05)。與CK相比，A6 和B6處理的Chl a、Chl b和Chl(a+b)含量降幅最大，分別下降了57.84%，52.78%，57.25%和68.62%，58.83%，65.94%。

表3 不同鹽堿脅迫對越橘‘北陸’葉片葉綠素含量的影響Table 3 Effects of different saline-alkali stress treatments on chlorophyll content of ‘Northland’ blueberry mg/g

2.3 鹽堿脅迫對越橘幼苗抗氧化生理指標的影響

由表4可知，隨著復合鹽(A類處理)和堿性鹽(B類處理)鹽濃度的升高，越橘‘北陸’葉片細胞膜透性呈升高趨勢。在復合鹽處理中，除A1、A2處理外，其他處理的細胞膜透性與CK差異顯著(P<0.05)；在堿性鹽處理中，除了B1處理外，其他處理的細胞膜透性與CK差異顯著(P<0.05)。當鹽濃度相同時，堿性鹽處理的細胞膜透性高于復合鹽。

由表4還可知，隨著鹽濃度升高，復合鹽和堿性鹽處理越橘‘北陸’葉片可溶性蛋白、可溶性糖、Pro、MDA含量和SOD、CAT活性均呈先增大后減小的趨勢。除個別處理外，大部分鹽堿脅迫處理的SP、SS、Pro、MDA含量和SOD、CAT活性與CK差異顯著(P<0.05)。

表4 不同鹽堿脅迫對越橘‘北陸’葉片抗氧化生理指標的影響Table 4 Effects of different saline-alkali stress treatments on antioxidant physiological indexes of ‘Northland’ blueberry leaves

2.4 鹽堿脅迫對越橘葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

由圖2所示，越橘葉片由上表皮、下表皮、柵欄薄壁組織、海綿薄壁組織和中脈組成，其中柵欄薄壁組織由兩層不規(guī)律的薄壁細胞組成，上、下表皮由一層排列緊密、大小不一的薄壁細胞組成。

由表5可知，復合鹽處理(A處理)中，隨著鹽濃度的增加，越橘葉片厚度、下表皮厚度、海綿薄壁組織厚度、中脈厚度和SR總體上呈降低的趨勢，上表皮厚度、柵欄薄壁組織厚度、CTR均呈先升高后降低的趨勢，柵/海無明顯變化規(guī)律，其中當鹽濃度為90 mmol/L(A3處理)時，上表皮厚度和CTR均達到最大值。除A1處理外，其他處理各指標大多與CK差異顯著(P<0.05)。

由表6可知，在堿性鹽處理(B處理)中，隨著鹽濃度的增加，越橘葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄薄壁組織厚度、海綿薄壁組織厚度、中脈厚度和SR總體上均呈降低的趨勢； CTR、柵/海均無明顯變化規(guī)律，且當鹽濃度為150 mmol/L(B5處理)時，二者均達最大值。除B1、B2處理外，其他處理的葉片厚度、柵欄薄壁組織厚度、中脈厚度、CTR均與CK差異顯著(P<0.05)；除B1處理外，其他處理的上表皮厚度、海綿薄壁組織厚度和SR均與CK差異顯著(P<0.05)；各處理下表皮厚度均與CK差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同鹽堿脅迫處理下越橘‘北陸’葉片解剖結(jié)構(gòu)的顯微觀察(×100)Fig.2 Microscopic observation of leaf anatomical structure of ‘Northland’ blueberry under different salt-alkali stress treatments (×100)

表5 復合鹽脅迫對越橘‘北陸’葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Table 5 Effect of compound salt stress on anatomical structure of ‘Northland’ blueberry leaves

表5(續(xù)) Continued table 5

表6 堿性鹽脅迫對越橘‘北陸’葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響Table 6 Effects of alkaline salt stress on anatomical structure of ‘Northland’ blueberry leaves

2.5 鹽堿脅迫下越橘葉片各生理指標間的相關(guān)性分析

由表7可知，堿性鹽脅迫處理下，越橘葉片Chl a、Chl b和Chl(a+b)與CMP均呈極顯著負相關(guān)，與SP均呈極顯著正相關(guān)；Chl a與Chl b和Chl(a+b)均呈極顯著正相關(guān)；Chl b與CAT呈顯著負相關(guān)，與Chl a呈極顯著正相關(guān)；CMP與SP呈極顯著負相關(guān)；SS與Pro、MDA和CAT均呈極顯著正相關(guān)；Pro與MDA和CAT均呈顯著正相關(guān)，與SOD呈極顯著正相關(guān)；MDA與CAT呈極顯著正相關(guān)。

表7 堿性鹽脅迫下越橘葉片不同生理生化指標間的相關(guān)系數(shù)Table 7 Correlation coefficients of chlorophyll content and physiological and biochemical indexes of blueberry leaves under alkaline salt stress

由表8可知，復合鹽脅迫處理下，CMP與SP呈顯著負相關(guān)，與Chl a、Chl b和Chl(a+b)均呈極顯著負相關(guān)；SP與Chl a+b呈極顯著正相關(guān)；SS與Pro、SOD和CTA呈顯著正相關(guān)，與MDA呈極顯著正相關(guān)，與Chl(a+b)和Chl a呈顯著負相關(guān)；Pro與SOD和CAT呈極顯著正相關(guān)；MDA與Chl a、Chl b和Chl(a+b)呈顯著負相關(guān)；SOD與CAT呈極顯著正相關(guān)；Chl a、Chl b和Chl(a+b)三者之間呈極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果表明,越橘在復合鹽和堿性鹽環(huán)境下，葉片會通過增加體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和提高抗氧化酶活性來抵御脅迫環(huán)境，提高其對不同鹽堿環(huán)境的適應能力。

表8 復合鹽脅迫下越橘葉片生理生化指標間的相關(guān)系數(shù)Table 8 Correlation coefficients of chlorophyll content and physiological and biochemical indexes of blueberry leaves under compound salt stress

3 討 論

葉片是植物的光合作用器官，其外觀形態(tài)能反映植物生長狀況。本試驗結(jié)果表明，90 mmol/L復合鹽處理越橘葉片開始失綠，而60 mmol/L堿性鹽處理葉片即開始失綠，說明堿性鹽對越橘‘北陸’損傷更嚴重，這與張曉婷等[14]的研究結(jié)果相似。

葉綠體是植物光合作用的細胞器，其中Chl a、Chl b是主要的光合色素，直接參與光合作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫下6種葡萄砧木葉片的葉綠素含量均不同程度地下降[22]。紫花苜?！⒌夏取汀佤敗~片的葉綠素含量在受到鹽脅迫后顯著降低[23]。本試驗結(jié)果表明，與CK相比，當復合鹽濃度高于90 mmol/L時，越橘葉片Chl b含量顯著降低(P<0.05)；當復合鹽濃度高于60 mmol/L時，Chl a和Chl(a+b)含量顯著降低(P<0.05)；當堿性鹽濃度高于60 mmol/L時，Chl b與Chl(a+b)含量顯著降低(P<0.05)，可知復合鹽和堿性鹽均能使越橘葉綠素合成受阻，其中堿性鹽的作用更強，這與Carter等[24]的研究結(jié)果一致。

大多數(shù)情況下，鹽堿地土壤滲透壓會高于植物細胞滲透壓，導致植株水分外滲產(chǎn)生滲透脅迫，引發(fā)生理干旱，影響植株正常生長[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，當復合鹽濃度低于60 mmol/L、堿性鹽濃度低于30 mmol/L時，越橘葉片的細胞膜透性均能維持正常水平，之后隨著鹽濃度的增大，細胞膜透性顯著增加；在同一處理濃度間比較發(fā)現(xiàn)，堿性鹽對細胞膜透性的破壞更嚴重，這與堿性鹽土壤pH較高有關(guān)。

植物受到鹽堿脅迫后體內(nèi)會積累大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)，使脂膜過氧化，導致植株體內(nèi)產(chǎn)生有毒物質(zhì)MDA。本試驗結(jié)果顯示，與CK相比，鹽堿脅迫會使越橘葉片MDA含量顯著增加，其中150 mmol/L復合鹽和120 mmol/L堿性鹽脅迫處理的MDA含量均最大，說明復合鹽和堿性鹽破壞了植株正常的生理代謝系統(tǒng)。此外，相同鹽濃度下，堿性鹽處理的MDA含量總體高于復合鹽處理，說明堿性鹽對植株產(chǎn)生的傷害更強。

滲透調(diào)節(jié)是植物應對逆境脅迫的重要生理機制，鹽堿脅迫時植物細胞會合成Pro、甜菜堿、糖類等有機物質(zhì)來調(diào)節(jié)體內(nèi)的滲透平衡[27]。研究證明，高濃度鹽堿脅迫下，酸棗幼苗[28]和鹽柳幼苗[29]中游離Pro會大量積累以適應鹽漬環(huán)境變化。羅布麻幼苗可通過增加Pro、SS、甜菜堿等有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來抵御鹽脅迫傷害[30]。本研究中，在2種鹽脅迫處理下，越橘‘北陸’葉片的Pro、SS、SP含量隨著鹽濃度的升高均呈先升高后降低的趨勢，且3種物質(zhì)含量總體高于CK，說明越橘‘北陸’會通過增加自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持滲透平衡來抵御鹽堿環(huán)境，這與前人研究結(jié)果一致。本研究中，60 mmol/L復合鹽和30 mmol/L堿性鹽脅迫處理下越橘葉片SP含量均達到最大值，在120 mmol/L復合鹽和90 mmol/L堿性鹽脅迫處理下葉片SS含量均達到最大值，在90 mmol/L復合鹽和90 mmol/L堿性鹽脅迫處理下葉片Pro含量均達到最大值，說明低濃度復合鹽和堿性鹽均能誘導越橘植株產(chǎn)生Pro、SS、SP來提高自身對鹽堿環(huán)境的抵御能力；但當復合鹽和堿性鹽濃度較高時，Pro、SS、SP含量開始下降，說明高濃度復合鹽和堿性鹽會影響植株P(guān)ro、SS、SP合成，導致其含量降低。

植物體內(nèi)存在一套完整的活性氧清除體系，用于清除脅迫環(huán)境中植株體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧，增強植物對逆境的抵抗能力，保證正常的生命活動。SOD是植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，在逆境脅迫和衰老進程中，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生能力大于清除能力，SOD等活性氧清除劑具有維持活性氧代謝平衡、保護膜結(jié)構(gòu)的功能[31-33]。有研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫能顯著提高‘大果沙棗’的SOD活性[34]。本試驗結(jié)果顯示，隨著鹽濃度的升高，越橘葉片SOD活性呈先升高后降低趨勢，但總體高于CK，說明復合鹽和堿性鹽均會提高越橘葉片SOD活性，這與前人研究結(jié)果一致。張曉婷等[14]發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的增大CAT活性上升。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增加，復合鹽和堿性鹽處理越橘葉片CAT活性均呈先增后減趨勢，但總體均高于CK，說明復合鹽和堿性鹽會提高CAT活性，這與前人研究結(jié)果一致。

葉片是植物應對環(huán)境變化最敏感且可塑性較強的器官，在應對不同的生長環(huán)境時會形成不同的適應類型。鹽脅迫下植物葉片內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯的變化，因此葉片的解剖結(jié)構(gòu)能反映植株對鹽堿的耐受性[35-36]。本研究結(jié)果表明，在復合鹽和堿性鹽處理下，越橘葉片的厚度較CK明顯變薄，這與Parida等[37]的研究結(jié)果一致。本研究中，在復合鹽和堿性鹽處理中，當鹽濃度高于90 mmol/L時葉片的柵欄薄壁組織厚度顯著降低(P<0.05)，當鹽濃度高于60 mmol/L時葉片的海綿薄壁組織厚度顯著降低(P<0.05)，說明鹽堿脅迫對越橘葉片海綿薄壁組織的影響比柵欄薄壁組織更大，這與田晨霞等[38]的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在復合鹽處理中，隨著鹽濃度的升高，越橘葉片上表皮厚度呈先增大后減小的趨勢，且總體高于CK，說明在應對復合鹽脅迫環(huán)境時，越橘葉片會通過增加上表皮厚度來維持葉片的正常結(jié)構(gòu)。中脈在葉片中起著支持和輸導的作用，是植物運輸水分和同化物的重要組織。戴凌燕等[39]研究發(fā)現(xiàn)，蘇打鹽堿脅迫可顯著減小甜高粱葉片厚度、中脈厚度。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK相比，復合鹽和堿性鹽處理葉片中脈厚度均降低，這與王躍等[40]的研究一致。本研究中，與CK相比，復合鹽和堿性鹽處理葉片的CTR總體增大，SR總體降低，這與前人對黑枸杞[41]、海島棉[42]、黃花草木樨[43]的研究結(jié)果一致。

植物對鹽堿環(huán)境的響應是一個復雜的過程[44-45]。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果表明，細胞膜透性與Chl a、Chl b和Chl(a+b)均呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，可能是由于一定濃度的鹽堿破壞了葉片細胞膜透性，從而損害了葉綠素的合成與積累。復合鹽處理下，CAT與SOD呈極顯著正相關(guān)；SS與CAT、SOD呈顯著正相關(guān)，Pro與CAT、SOD呈極顯著正相關(guān)，SS與Pro、SOD呈顯著正相關(guān)。堿性鹽處理下，SS與Pro、MDA和CAT均呈極顯著正相關(guān)；Pro與MDA和CAT均呈顯著正相關(guān)，與SOD呈極顯著正相關(guān)。結(jié)果表明，越橘會通過滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)共同抵御鹽堿環(huán)境的脅迫。