韋仕南，周志楠，陳浩翰，陳 祥*

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025）

從動物遺傳育種的角度探究如產(chǎn)奶量、產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)肉率等經(jīng)濟性狀基因的遺傳學作用，可使人們在將來培育出更有利于人類生產(chǎn)的畜禽品種，從而造福人們。因此，與產(chǎn)羔數(shù)相關的主要調(diào)控基因的篩選一直是研究熱點。近年來，已發(fā)現(xiàn)許多影響羊繁殖力的主效基因和候選基因，其中就包括生長分化因子9（）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（）。基因是由卵母細胞分泌的一種生長因子，是家畜高繁殖力的候選基因，它調(diào)控著與卵丘擴張繁殖相關的幾種關鍵的顆粒細胞酶，是卵巢中啟動卵泡發(fā)育以及調(diào)節(jié)排卵率的必需生長因子之一。同時還參與調(diào)節(jié)動物的生殖性狀。作為一個主要的影響產(chǎn)羔數(shù)性狀的基因，在早期卵泡的生長和分化的調(diào)控作用方面人們已經(jīng)投入了大量的研究。有研究發(fā)現(xiàn)在綿羊卵巢中高水平表達，蛋白質(zhì)編碼區(qū)全長約2.5kb，由2 個外顯子和1 個內(nèi)含子組成，可編碼453 個氨基酸，能夠參與影響早期卵泡的發(fā)育和分化。Dong 等研究發(fā)現(xiàn)，通過對小鼠和綿羊的基因功能失活或表達沉默，造成卵泡發(fā)育停滯，卵巢不能正常排卵，從而導致小鼠和綿羊繁殖機能障礙。有研究結果表明，基因可以促進原始卵泡向初級卵泡發(fā)育，缺失該基因則導致初級卵泡無法形成，導致雌性不孕。

與基因結構同源且功能類似，故又被稱為。BMP15 蛋白是骨形態(tài)發(fā)生蛋白中的一員，BMP15 蛋白作為一種卵母細胞分泌因子（Oocyte-Secreted Factor，OSF），主要在雌性動物卵母細胞中表達并被分泌到胞外，通過結合到卵母細胞周圍顆粒細胞/鞘細胞膜上的特異性受體行使生物學功能。綿羊的基因位于Χ 染色體上，CDS 區(qū)長度為1 182 bp，其中包括2 個外顯子和1 個內(nèi)含子。程俐芬等通過比較已知的基因產(chǎn)物的肽鏈，發(fā)現(xiàn)其在哺乳動物中高度保守，具有高度同源性。研究表明，能夠以同源二聚體或與形成異源二聚體的方式參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和固醇類激素生成等生理過程。Otsuka 等人發(fā)現(xiàn)能通過抑制卵泡雌激素受體在顆粒細胞中的表達來抑制顆粒細胞分化。

大量研究表明，和基因在動物卵泡發(fā)育中具有協(xié)同作用，其共同作用于卵泡的早期發(fā)育。卵母細胞分泌因子和通過旁分泌/自分泌信號通路在原始卵泡發(fā)育、排卵過程、黃體形成、顆粒細胞增殖和卵母細胞成熟等過程中發(fā)揮重要作用。和之間因缺乏半胱氨酸殘基而不能形成分子間二硫鍵，但是它們能夠組成非共價鍵二聚體，并且共同表達時還能夠形成異源二聚體。和能夠幫助卵丘細胞合成胞內(nèi)膽固醇，還可以協(xié)同促進卵丘細胞增殖和卵母細胞成熟。因此，研究和基因在黔北麻羊單/ 多羔組各組織中的表達規(guī)律，對黔北麻羊育種及提高經(jīng)濟性狀具有重要的意義。

黔北麻羊又名麻羊，是貴州省地方優(yōu)良山羊品種，主要產(chǎn)自貴州省北部，屬皮肉兼用型品種，它對環(huán)境具有較強的適應性，有著耐粗飼、抗病力強、繁殖性能好、繁殖周期長、一年四季皆可發(fā)情等優(yōu)點。近幾年，與基因在綿羊、雞、豬上已有大量研究，但2 種基因mRNA 表達譜在黔北麻羊上的研究卻很少。本實驗通過實時熒光定量PCR 分析初步探究基因和基因在單、多羔黔北麻羊子宮、垂體、輸卵管、下丘腦和卵巢5 個組織樣中的表達水平，為今后深入研究影響黔北麻羊繁殖力因素提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 隨機收集相同飼養(yǎng)條件下單羔和多羔經(jīng)產(chǎn)母羊（各3 只）的組織樣本，參照貴州省地方《羊屠宰操作規(guī)程》（DB22/T 2740-2017）標準進行屠宰，用經(jīng)高溫滅菌消毒后的剪刀、鑷子等器材采集適量且新鮮的子宮、輸卵管、垂體、下丘腦和卵巢組織，用馬克筆做好標記后放入低溫液氮中保存以防樣品腐壞，轉存于-80℃冷凍室內(nèi)，便于下一步實驗的順利進行。

1.2 主要儀器與試劑 實驗主要儀器有實時熒光定量PCR儀（美國Thermo Fisher 公司CFΧ96 Real-Time System），旋渦混勻器（上海漢諾儀器有限公司ΧH-D），微型掌上離心機（北京東林昌盛生物科技有限公司DL200），制冰機（日本三洋電器有限公司SIM-F140），高速冷凍離心機（安瑪西亞中國有限公司NANODROP 2000），以及購自美國BIO-RAD 公司的凝膠成像系統(tǒng)（C1000 Touch）、電泳儀（Universal Hood II）、超微量紫外分光光度計（PowerPacTM HV Power Supply）等。

TRIzol 試劑盒購自貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司，cDNA 第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，0.5%TAE 緩沖液、液氮、實時熒光定量mix、氯仿、75%乙醇、瓊脂糖、異丙醇均于貴州鼎國生物有限公司采購。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA 提取 采用Trizol RNA 裂解法提取各組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整性，使用超微量分光光度計檢測其濃度和純度（D/D=1.8～2.0），檢測結果顯示所提取RNA 呈單峰、無雜峰，濃度較高，純度較好，置于冷凍室保存可用于下一步反應的進行。

1.3.2 cDNA 第一鏈的合成 依照逆轉錄試劑盒說明書的步驟對各組織總RNA 逆轉錄合成cDNA 第一鏈。合成體系具體如下：dNTP Mix 2.5 mm Each 4 μL，Primer Mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，RNA 模板1 μL，DTT（0.1 m）2 μL，HiFi Script 1 μL，RNase-Free Water 6 μL。用普通PCR 儀42℃孵育50 min，85℃下孵育5 min，最后用超微量紫外分光光度計進行PCR 產(chǎn)物的濃度和純度檢測，放入-20℃冰箱保存。cDNA 提取全程均在冰上進行。

1.3.3 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank 上已經(jīng)發(fā)布的山羊基因序列（登錄號：EU888137.1）、基因序列（登錄號：NM_001285708.1）利用Primer Premier 5.0 軟件分別設計2 對引物，引物信息見表1。選取-為內(nèi)參基因，引物交由重慶擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3.4 實時熒光定量PCR 條件優(yōu)化及反應 以-基因為內(nèi)參基因，對采集的單、多羔組黔北麻羊的5 個性腺組織、基因mRNA 進行實時熒光定量PCR 檢測，溶解曲線由機器自動設置，每個樣品各設3 個重復。熒光定量反應體系如下：（2×）SYBR Premix Ex Taq酶5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，dd HO 3 μL。熒光定量反應程序如下：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性45 s，65 ℃退火15 s，72℃延伸30 s，39 個循環(huán)。在此過程中，對退火溫度和引物濃度等客觀可調(diào)節(jié)因素進行了探索，以尋找并選用最佳反應條件。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)獲得的CT 值，通過2方法計算出的目標基因的相對表達量。數(shù)據(jù)用Excel 進行處理，并繪制相應的柱形圖。采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，采用LSD 法進行差異顯著性檢驗。結果以“平均數(shù)±標準差”表示，在0.01 和0.05 水平進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1、基因普通PCR 擴增產(chǎn)物檢測 由圖1 可知，擴增片段與靶片段相同，長度分別為166 bp 和199 bp，清晰度高，特異性強，無拖帶現(xiàn)象，沒有發(fā)現(xiàn)引物的3'端間相互錯配擴增現(xiàn)象，可直接用于下一步實驗。

圖1 BMP15、GDF9 基因PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖像

2.2 qPCR 產(chǎn)物特異性分析 通過對基因和基因進行qPCR 擴增獲得的擴增曲線和溶解曲線如圖2、圖3 所示?？梢钥闯?，溶解曲線和擴增曲線都顯示出單峰現(xiàn)象，擴增產(chǎn)物具有特異性，熒光反應明顯，沒有出現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物和其他引物二聚體異峰。這表明黔北麻羊基因和基因的擴增結果是合理的，具有良好的代表性。說明定量檢測結果精確可信，獲得的數(shù)據(jù)可用于分析接下來的測試結果。

圖2 BMP15 基因在黔北麻羊單、多羔組不同組織擴增曲線與溶解曲線

圖3 GDF9 基因在黔北麻羊單、多羔組不同組織擴增曲線與溶解曲線

2.3、基因在單羔與多羔黔北麻羊各組織之間的相對表達分析 由圖4 可知，基因在單、多羔黔北麻羊的性腺軸5 個組織中表達的高低順序不相同。單羔組中基因在5 種組織中的表達量由多到少的順序為：卵巢＞垂體＞輸卵管＞下丘腦＞子宮，而且基因在卵巢組織中的相對表達極顯著高于垂體、輸卵管、下丘腦和子宮，其他的組織之間差異不明顯；多羔組5 個組織中基因的相對表達順序依次為：卵巢＞垂體＞下丘腦＞輸卵管＞子宮。卵巢和垂體之間表達差異為極顯著，且垂體極顯著高于下丘腦、輸卵管和子宮，下丘腦、子宮和輸卵管之間的差異不顯著?？傮w上單羔和多羔的表達趨勢趨于一致。通過組間比較發(fā)現(xiàn)基因在多羔組的垂體相對表達量顯著高于單羔組，在輸卵管中單羔組的相對表達量顯著高于多羔組，其余組織間則差異不顯著。

圖4 GDF9 基因在黔北麻羊各組織mRNA 的相對表達量

由圖5 可知，基因在單羔組和多羔組的5個組織中的相對表達趨勢相近，均為在卵巢中表達最高。單羔組基因在5 個組織中的相對表達量順序為：卵巢＞輸卵管＞垂體＞下丘腦＞子宮，其中卵巢相對其他4 個組織表達差異為極顯著，輸卵管相對于子宮的表達差異為極顯著，垂體相比較于子宮差異也達到了極顯著水平，而輸卵管相對于下丘腦的表達僅為顯著，下丘腦和子宮之間的相對表達為不顯著；基因在多羔組5 個組織中的相對表達量由高到低順序為：卵巢＞垂體＞下丘腦＞輸卵管＞子宮，基因在卵巢中的相對表達量極顯著高于其他4 個組織，基因在垂體中的相對表達量顯著高于下丘腦、輸卵管和子宮，下丘腦、子宮和輸卵管之間差異不顯著。通過組間比較發(fā)現(xiàn)，基因在單羔組輸卵管中的表達極顯著高于多羔組，而在單羔組子宮中的相對表達量僅顯著高于多羔組，其余組織間則差異不顯著。

圖5 BMP15 基因在黔北麻羊各組織mRNA 的相對表達量

3 討 論

3.1 黔北麻羊基因在5 個性腺組織中的表達規(guī)律TGF-家族和BMP 信號通路是目前有關綿羊多羔性狀候選基因的研究熱點。作為TGF-家族重要成員之一的GDF9是哺乳動物和卵生動物卵巢內(nèi)重要的調(diào)節(jié)因子。近年來，研究證實基因能夠促進母羊前腔卵泡的生長成熟，并直接影響母羊的多羔生產(chǎn)性能。習欠云等人發(fā)現(xiàn)基因mRNA 在小鼠的性腺軸器官上皆有表達，且發(fā)現(xiàn)對的下調(diào)可使實驗對象的生殖能力及生長發(fā)育有所改變，與本實驗在黔北麻羊單、多羔組的性腺軸組織中均有表達的結果相同，但基因在多羔組的垂體和卵巢中的表達相比較于單羔組顯示為上調(diào)，與上述發(fā)現(xiàn)有出入，這可能與基因在不同物種的性腺組織中的表達規(guī)律不同。賈超在其發(fā)現(xiàn)中證明了基因在綿羊3 個成長階段的卵巢等組織中均有表達，并且不同年齡與組織之間都存在一定差異。其中2 月齡與本實驗的結果一致，mRNA 表達量均為卵巢＞輸卵管＞子宮，但與6 月齡和12 月齡的表達規(guī)律不符，故推測不同月齡母羊的各性腺組織表達規(guī)律不統(tǒng)一。這可能是由于該基因在卵泡早期發(fā)育時期較為活躍，隨著月齡增長卵泡后期發(fā)育已趨于完善，故6 月齡和12 月齡的母羊基因在卵巢表達量降低。田蕾等人分析了各個組織和器官中基因的表達，結果表明在牛的卵巢和子宮中該基因高水平表達，但在輸卵管、腎臟等器官表達水平偏低。這些結果均與本次實驗結果一致。因此，基因對于卵泡生長發(fā)育的影響非常關鍵，但其對山羊產(chǎn)羔能力的調(diào)節(jié)仍有待深入探討。

3.2 黔北麻羊基因在5 個性腺組織中的表達規(guī)律基因從發(fā)現(xiàn)和克隆至今已有近20 年的歷史，關于其功能的研究已有大量報道。體外細胞培養(yǎng)實驗、動物自發(fā)突變和基因敲除模型均表明，對哺乳動物的卵泡發(fā)育和卵巢正常功能的行使不可或缺。Dube 等人首先使用諾瑟雜交和原位雜交技術在卵巢卵母細胞中檢測到了的特異性表達。劉世佳等人對湖羊的研究中發(fā)現(xiàn)，基因在雄性湖羊的心臟、消化系統(tǒng)、性腺器官、脂肪等組織中均有表達，以十二指腸表達最多。但是在雌性湖羊卵巢中基因的表達明顯高于其他組織。董新龍等人發(fā)現(xiàn)在卵巢等性腺器官、內(nèi)臟器官、肌肉和脂肪組織中都有不同程度的表達，且該基因在卵巢組織中的表達明顯高于其他組織。本實驗研究結果為基因在黔北麻羊單、多羔組中的卵巢組織中均顯著高于其他組織，與上述研究結果一致。

有研究表明，和僅在哺乳動物卵巢中特定表達，但在之后的研究中發(fā)現(xiàn)它們在不同物種間表達的位置存在不同，表達量也并不統(tǒng)一。在鯉魚、牦牛的研究中也發(fā)現(xiàn)或基因在卵巢中高表達。Fenwick 等發(fā)現(xiàn)通過與相互協(xié)同促進小鼠的原始卵泡生長，并拮抗對原始卵泡顆粒細胞的凋亡。湯繼順等研究表明小尾寒羊的2 個基因在卵巢的表達量均較高，并推測在小尾寒羊卵巢中高表達可能與產(chǎn)羔數(shù)存在正相關，而較低表達猜測可能與產(chǎn)羔數(shù)有一定的負相關，與本實驗研究結果一致。這暗示基因可能作用于卵巢或抑制卵巢進一步分泌某種物質(zhì)從而直接或間接影響動物的繁育與發(fā)育。

4 結 論

本研究顯示、基因在單、多羔黔北麻羊5 個組織中均有表達，且表達趨勢一致，2 個基因在卵巢中的表達水平均為最高，在子宮中的表達水平較低，兩組織間均呈差異極顯著。表明、基因與黔北麻羊的卵巢發(fā)育可能存在聯(lián)系，卵巢可能是2 個基因的主要靶器官之一。