蘇 遠(yuǎn) 張蒙蒙 姚婷婷 趙 倩 王佳佳 章禮久 方海明

金絲桃素（Hyp）是貫葉連翹中的一種天然生物活性物質(zhì)，藥理活性具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用[1]。此外，由于Hyp具有疏水性強(qiáng)、與細(xì)胞膜親和力強(qiáng)、毒性低、光氧化活性高等優(yōu)點，被認(rèn)為是光動力療法的一種很有前途的光敏劑，在黑色素瘤等腫瘤光動力學(xué)治療方面的潛能越來越受到關(guān)注和重視[2]。慢性丙型肝炎患者連續(xù)口服0.05 mg·kg-1及0.1 mg·kg-1Hyp，共8周，血漿藥物濃度-時間曲線下面積和藥物峰濃度均進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化，呈現(xiàn)出非劑量依賴性[3]。關(guān)于Hyp低BA的原因及潛在原因尚不清楚。已知，首過代謝是導(dǎo)致藥物口服BA低的重要因素。肝臟代謝是大多數(shù)藥物口服首過代謝的主要發(fā)生部位。腸道黏膜同肝臟一樣，存在藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運蛋白，影響藥物吸收和代謝，產(chǎn)生腸道首過效應(yīng)。腸道首過效應(yīng)在口服藥物生利用度中的作用亦越來也受到關(guān)注。本課題前期建立的經(jīng)十二指腸（id）、門靜脈（ipv）以及外周靜脈（iv）置管建立的給藥通路動物模型能夠定量評估藥物肝臟和腸道首過效應(yīng)[4-5]。而肝臟首過效應(yīng)還是腸道的首過效應(yīng)對Hyp生物利用度的具體影響程度尚不清楚。為此，本研究利用本課題組前期建立的成熟的動物給藥模型探討經(jīng)十二指腸、門靜脈以及外周靜脈途徑給予不同劑量的Hyp的藥動學(xué)特征及定量估算其肝臟與腸道首過效應(yīng)，為提高Hyp口服BA提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 Hyp標(biāo)準(zhǔn)品為成都普瑞法公司產(chǎn)品（純度98%，NO.548-04-9），實驗所用甲醇，乙腈均為色譜純。

1.2 主要實驗儀器 日本島津LC-20AT型HPLC色譜儀以及LC色譜工作站。上海滬西WH-2微型漩渦混合儀、東京理化公司的氮吹儀等。

1.3 腸道-血管給藥通路動物模型的建立 ①實驗動物：Wistar大鼠，平均體質(zhì)量為（250±5）g，雌雄各半，由安徽肥東長臨河公司提供。②術(shù)前準(zhǔn)備：實驗前，大鼠禁止進(jìn)食食物至少12 h，但可以自由飲水。大鼠經(jīng)3 mL·kg-1的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后并仰臥位固定，參照前期文獻(xiàn)方法[4-5]，分別在大鼠頸動脈、id、ipv以及iv進(jìn)行置管，留置管末端用肝素帽封管并注射少量125 U·mL-1肝素鈉生理鹽水抗凝防止管腔堵塞。

1.4 Hyp藥代動力學(xué)檢測

1.4.1 血漿Hyp的HPLC檢測方法學(xué)建立 參照文獻(xiàn)并適當(dāng)改進(jìn)[6]。①大鼠血漿Hyp樣本前處理：參照文獻(xiàn)[6]，精密取大鼠血漿0.1 mL，加入0.3 mL甲醇/吡啶（9∶1）混合液后，渦旋振蕩1 min，14000 r/min離心3 min，取上清液，57 ℃氮氣吹干，加入200 μL流動相復(fù)溶，再次渦旋振蕩1 min，14000 r/min離心3 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析，HPLC檢測。②色譜條件：參照之前文獻(xiàn)[6]，LC-20AT型島津HPLC分析系統(tǒng)包括自動進(jìn)樣器、熒光檢測器、溫控箱以及色譜工作站組成。色譜柱：Kromasil C18柱（5 μm，4.6×200 mm）；流動相：甲醇/乙腈/1%磷酸二氫鈉=65/30/5；流速：1.0 mL/min；柱溫40 ℃；熒光檢測激發(fā)波長315 nm、檢測波長590 nm；進(jìn)樣20 μL。

1.4.2 Hyp不同給藥途徑下藥動學(xué)特征及肝臟-腸道首過代謝評估 每種給藥途徑分別設(shè)置低、中、高三個劑量組，每組6只大鼠。實驗前夜禁食、自由飲水，經(jīng)id給予Hyp（100 mg·g-1，200 mg·g-1，400 mg·kg-1，實驗前用0.1%羧甲基纖維素鈉溶液配成所需濃度）；ipv （50 mg·kg-1，100 mg·kg-1，200 mg·kg-1）和iv（50 mg·kg-1，100 mg·kg-1，200 mg·kg-1）給藥，并且于給藥前（0 min）及給藥后1 min、5 min、10 min、20 min、40 min、60 min、90 min、120 min和180 min經(jīng)頸動脈缺血0.3 mL。每個缺血時間點經(jīng)頸動脈取血后，均經(jīng)股靜脈注射等量生理鹽水。血標(biāo)本經(jīng)離心后取上清液-80 ℃保存，采取上述HPLC方法測定Hyp血藥濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 血漿藥物濃度-時間曲線（C-t）下面積（AUC）、半衰期（T1/2）、清除率（CL）等藥動學(xué)參數(shù)采用DAS2.0藥動學(xué)軟件分析，達(dá)峰時間（Tmax）、峰濃度（Cmax）等根據(jù)實測值取平均值。BA、肝臟提取率（Eh）以及腸道提取率（Ei）參照文獻(xiàn)方法計算[5-6]，即：BA=（AUCid/Doseid）/（AUCiv/Doseiv）；Eh=1-AUCipv/AUCiv；Ei=1-AUCid/AUCipv，其 中，AUCid為 經(jīng)id途 徑AUC值、Doseid為經(jīng)id途徑給藥劑量；AUCipv為經(jīng)ipv途徑AUC值、Doseipv為經(jīng)ipv途徑給藥劑量；AUCiv為經(jīng)iv途徑AUC值、Doseiv為經(jīng)iv途徑給藥劑量。采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，劑量資料采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，One-Way ANOVA分析考察組間的差別，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同給藥途徑下Hyp藥動學(xué)特征及腸道首過代謝評價

2.1.1 經(jīng)靜脈給予不同劑量的Hyp的C-t曲線及藥動學(xué)參數(shù)分析 經(jīng)外周靜脈給予（50～200）mg·kg-1Hyp，其C-t曲線及藥動學(xué)參數(shù)分別見圖1和表1。由表1可見，各劑量間AUCiv值隨Hyp藥物劑量升高而升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但劑量標(biāo)準(zhǔn)化后AUCiv值不呈劑量依賴性，T1/2、CL差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 經(jīng)靜脈給予不同劑量的Hyp藥動學(xué)參數(shù)（n=6）

圖1 靜脈給予不同劑量的Hyp 藥物濃度-時間（C-t）曲線（n=6）

2.1.2 經(jīng)門脈給予不同劑量的Hyp的C-t曲線及藥動學(xué)參數(shù)分析 經(jīng)門脈給予（50-200）mg·kg-1Hyp，其C-t曲線曲線及藥動學(xué)參數(shù)分別見圖2和表2。由表2可見，AUCipv值隨Hyp藥物劑量升高而升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但劑量標(biāo)準(zhǔn)化后AUCipv值不呈劑量依賴性；與同劑量外周靜脈AUC值相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各劑量間T1/2、CL差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 經(jīng)門脈給予不同劑量的Hyp藥物濃度-時間（C-t）曲線（n=6）

表2 經(jīng)門脈給予不同劑量的Hyp藥動學(xué)參數(shù)（n=6）

2.1.3 經(jīng)十二指腸給予不同劑量的Hyp的C-t曲線及藥動學(xué)參數(shù)分析 經(jīng)十二指腸給予（100-400）mg·kg-1Hyp，其C-t曲線及藥動學(xué)參數(shù)分別見圖3和表3。由表3可見，id給予不同劑量Hyp，均約在20 min內(nèi)達(dá)到血藥峰濃度，AUCid值隨Hyp劑量升高而升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但顯著低于同劑量門脈及外周靜脈AUC值，劑量標(biāo)準(zhǔn)化后AUCid值呈劑量非依賴性。各劑量間Tmax、T1/2、CL/F值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 經(jīng)十二指腸給予不同劑量的Hyp藥動學(xué)參數(shù)（n=6）

圖3 經(jīng)十二指腸給予不同劑量的Hyp藥物濃度-時間（C-t）曲線（n=6）

2.2 id給予不同劑量Hyp的BA、Eh和Ei值分析 id給予（100～200）mg·kg-1Hyp后，其BA、Eh和Ei見表4。

表4 id給予不同劑量Hyp的BA，Eh和Ei值分析（n=6）

3 討 論

口服給藥由于其方便性和副作用小，是目前臨床中最常用的給藥途徑，但口服給藥面臨的問題是存在生物利用度，甚至一些藥物因口服生物利用度低而導(dǎo)致應(yīng)用受限制?？诜o藥生物利用度低除了藥物腸道吸收以及藥物劑型的影響因素以外，經(jīng)歷顯著的首過效應(yīng)是主要原因。明確藥物首過效應(yīng)的發(fā)生部位以及可能的機(jī)制對于提高藥物生物利用度具有重要價值。

肝臟和腸道是首過效應(yīng)主要發(fā)生部位，但進(jìn)行藥物首過效應(yīng)研究過程中如何甄別肝臟和（或）腸道首過代謝部位以及作用程度存在困難。本課題組前期建立經(jīng)腸道、門靜脈以及外周靜脈置管建立的腸道血管給藥途徑的動物模型能夠定量評價藥物腸道首過效應(yīng)發(fā)生部位及進(jìn)行機(jī)制研究，該方法成熟可靠、重復(fù)性好。利用該模型，我們定量評價了不同藥物的肝臟和腸道首過代謝[4-8]。通過前期的研究，本課題組掌握了通過HPLC測定大鼠血漿中Hyp含量，該方法專屬性好、靈敏度高、可靠性強(qiáng)[6]。本研究中，我們經(jīng)IVAP大鼠模式給予同劑量Hyp，十二指腸、門靜脈以及外周靜脈Hyp的AUC值隨劑量增加而增加，劑量標(biāo)準(zhǔn)化以后AUC值不呈現(xiàn)劑量依賴性，但十二指腸AUC值顯著低于門靜脈和外周靜脈AUC值，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。AUCipv略低于AUCiv，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，增加Hyp劑量不能顯著提高絕對生物利用度。Hyp經(jīng)歷了顯著的首過效應(yīng)，肝臟提取率占17%左右，而腸道提取率占88%～94%，腸道是Hyp首過效應(yīng)主要發(fā)生部位。

對某些藥物而言，腸道首過效應(yīng)起主要作用[9-10]。因此，腸道首過效應(yīng)在低口服生物利用度中的作用不容忽視，且抑制腸道CYP3A4代謝酶及P-糖蛋白轉(zhuǎn)運體酶活性可能是提高口服藥物生物利用度的有效途徑[4，6]。有研究證實[10]，貫葉金絲桃的活性成分能誘導(dǎo)細(xì)胞色素P450（CYP）3A4酶及腸道P-糖蛋白（P-gp）的轉(zhuǎn)運活性，改變經(jīng)胃腸道吸收藥物的代謝過程，影響藥物口服生物利用度。因此，是否可以使用抑制CYP3A4代謝酶及P-gp活性的藥物，提高金絲桃素口服生物利用度，我們后續(xù)將進(jìn)行這方面研究。