◎ 馮慧慧，楊亞琴，余明霞，曹 秀，李圓圓，郝學(xué)飛

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（鄭州），河南 鄭州 450002）

磺胺類藥物是對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，因其具有性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、殺菌效果好、使用方便和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中仍然廣泛使用，主要用于預(yù)防和治療魚、蝦、蟹等動(dòng)物的細(xì)菌感染性疾病[1-2]。由于磺胺類藥物在生物體內(nèi)作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，在水產(chǎn)品體內(nèi)蓄積到一定濃度，經(jīng)食用后會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用，引發(fā)排尿和造血紊亂等副作用和過敏反應(yīng)，使免疫功能下降，致殘、致畸、致突變，并且可能產(chǎn)生致癌作用[3]。因此，我國(guó)以及美國(guó)、歐盟等多數(shù)國(guó)家對(duì)食品中磺胺類藥物殘留最高限量均有明確規(guī)定，如我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）規(guī)定所有食品動(dòng)物肌肉、脂肪、肝和腎中磺胺類藥物的最大殘留限量為100 μg·kg-1[4]。近年來(lái)，磺胺類藥物殘留的問題也越來(lái)越受社會(huì)的關(guān)注，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、各地方政府等也多次組織實(shí)施水產(chǎn)品例行監(jiān)測(cè)、專項(xiàng)監(jiān)測(cè)等各類抽檢工作，以確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

能力驗(yàn)證是通過各實(shí)驗(yàn)室之間的比對(duì)，來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)室能力進(jìn)行考核、監(jiān)督和確認(rèn)的一種驗(yàn)證活動(dòng)，它可以作為質(zhì)量控制的外部補(bǔ)充措施，以促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力和質(zhì)量管理水平的不斷提高[5-6]。本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)也多次參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的能力驗(yàn)證考核活動(dòng)，本文以2021年參加農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留檢測(cè)能力驗(yàn)證為例，檢測(cè)方法推薦使用《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定》（農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008）[7]，優(yōu)化了提取溶劑和凈化方式，對(duì)考核樣品中磺胺類藥物殘留量進(jìn)行測(cè)定，取得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LCMS-8050液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；色譜柱：C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm），日本資生堂公司；PGC 4502i電子天平，精確至0.01 g，艾德姆衡器（武漢）有限公司；AE 240電子天平，精確至0.01 mg，梅特勒-托利多；飛鴿GL-21B 高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SKQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SK-1快速混勻器，金壇市白塔新寶儀器廠；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司。乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司；甲酸：色譜純，賽默飛世爾科技公司；固相萃取凈化柱：Oasis PRiME HLB，規(guī)格為500 mg/6 mL，美國(guó)Waters公司。

磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺間二甲氧嘧啶、氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3以及氘代磺胺間二甲氧嘧啶-D6共計(jì)10種化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司，純度均大于99.0%。

能力驗(yàn)證樣品：離心管包裝的鯉魚魚糜，共3份樣品（每份樣品5.00 g），空白基質(zhì)樣品約50 g。檢測(cè)樣品編號(hào)為H47，由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品提取

樣品充分解凍至室溫，加入200 ng·mL-1混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，渦旋混合1 min，避光放置1 h，再加入20 mL乙腈進(jìn)行提取，渦旋混合2 min，室溫下超聲提取10 min，以8 000 r·min-1高速離心5 min，取上清液于50 mL燒杯中；殘?jiān)?0 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，待過柱凈化。

1.2.2 樣品凈化

將全部上清液轉(zhuǎn)移至Oasis PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，保持流速1～2滴/s，收集全部濾液于梨形瓶中，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2 mL 20%甲醇水渦旋溶解殘留物，過0.22 μm微孔濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

在測(cè)定能力驗(yàn)證樣品時(shí)，先取出一份樣品按照上述方法進(jìn)行預(yù)處理粗略定量。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)粗略定量結(jié)果，考核樣品中磺胺甲基嘧啶濃度大約為24 μg·kg-1，磺胺二甲嘧啶濃度大約為40 μg·kg-1。可根據(jù)這個(gè)量進(jìn)行加標(biāo)樣品的制備，再根據(jù)加標(biāo)樣品的實(shí)測(cè)值和添加量計(jì)算出添加回收率，由此可以對(duì)考核樣品的測(cè)定值進(jìn)行校正，另外可以根據(jù)初測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確配制標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，使能力驗(yàn)證樣品中磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲嘧啶上機(jī)液濃度涵蓋在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，且在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中區(qū)值，使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。

1.2.3 樣品檢測(cè)

（1）色譜條件。色譜柱：資生堂C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相A路：5 mmol·L-1甲酸-甲酸銨水溶液；流動(dòng)相B路：甲醇∶乙腈（V∶V）=1∶1；流速：0.20 mL·min-1；梯度洗脫程序詳見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

（2）質(zhì)譜條件。離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；霧化氣：空氣，流速3.0 L·min-1；干燥氣：氮?dú)?，流?0.0 L·min-1；加熱氣：氮?dú)?，流?0.0 L·min-1；離子源接口溫度：300 ℃；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；碰撞誘導(dǎo)電離氣體壓力270 kPa，各化合物質(zhì)譜采集信息詳見表2。

表2 磺胺類藥物質(zhì)譜參數(shù)信息表

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)結(jié)果

樣品經(jīng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)后，檢測(cè)結(jié)果見表3，磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜見圖1，考核樣品圖譜見圖2，經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部能力驗(yàn)證通報(bào)，此次考核結(jié)果合格。

圖1 磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（20 ng·mL-1）總離子流圖

圖2 考核樣品總離子流圖

表3 考核樣品檢測(cè)結(jié)果表

2.2 提取溶劑的優(yōu)化與選擇

《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008）[7]選用1%甲酸乙腈作為提取溶劑，主要是針對(duì)磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的同時(shí)測(cè)定，適量的甲酸更有利于喹諾酮類藥物的提取。本次考核只涵蓋其中8種磺胺類藥物（磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺喹噁啉和磺胺間二甲氧嘧啶），結(jié)合磺胺類藥物本身的性質(zhì)，考前做多次預(yù)備實(shí)驗(yàn)，比較標(biāo)準(zhǔn)中所用的1%甲酸乙腈和乙腈作為提取劑對(duì)化合物靈敏度和實(shí)驗(yàn)回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，選用乙腈作為提取劑時(shí)，磺胺類藥物響應(yīng)明顯提高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好，與劉新輝[8]、蔣定之[9]文中提到隨著甲酸比例的增加，磺胺類等堿性化合物回收率降低的研究結(jié)果一致。因此，選用乙腈作為本次考核實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對(duì)磺胺類藥物響應(yīng)值的影響圖（n=3）

2.3 凈化方式的優(yōu)化與選擇

用新型固相萃取凈化柱Oasis PRiME HLB代替正己烷液液萃取除脂凈化。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008）[7]關(guān)于磺胺類藥物檢測(cè)的前處理凈化步驟較少，只是將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后的殘留物復(fù)溶，用2 mL正己烷液液萃取除脂凈化后上機(jī)測(cè)定。

因水產(chǎn)品中含有大量蛋白質(zhì)、脂肪、磷脂等化合物，傳統(tǒng)的正己烷液液萃取不能有效去除樣品中的蛋白質(zhì)和卵磷脂，容易造成基質(zhì)干擾，影響離子化效率，從而影響化合物的靈敏度，且凈化不徹底會(huì)對(duì)儀器色譜柱和質(zhì)譜端造成較大污染。因此，本研究選用了目前新型Oasis PRiME HLB柱，不需要活化、淋洗、洗脫等步驟，操作簡(jiǎn)單快速，可有效去除樣品中脂肪、蛋白質(zhì)、內(nèi)源性磷脂類等物質(zhì)干擾，極大地減少干擾物對(duì)目標(biāo)化合物的影響，且減小基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果的影響[8-10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明Oasis PRiME HLB凈化柱對(duì)磺胺類化合物吸附很少，回收率穩(wěn)定可滿足檢測(cè)要求，詳見圖4。

圖4 經(jīng)Oasis PRiME HLB柱凈化后化合物回收率情況圖（n=3）

3 獸藥殘留能力驗(yàn)證注意事項(xiàng)及質(zhì)量控制分析

3.1 能力驗(yàn)證前注意事項(xiàng)

3.1.1 所用試劑、器皿的處理

將實(shí)驗(yàn)過程中所用到的器皿按照規(guī)定要求清洗，并用甲醇潤(rùn)洗，對(duì)于口徑較小的進(jìn)樣小瓶，可用甲醇超聲清洗，盡量避免實(shí)驗(yàn)器皿帶來(lái)的外源污染。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效期、結(jié)構(gòu)、純度，根據(jù)標(biāo)識(shí)的純度進(jìn)行折算，部分磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品在甲醇中的溶解度不好，可以加入適量甲酸超聲助溶。

3.1.3 儀器條件的優(yōu)化

確認(rèn)實(shí)驗(yàn)過程中所用到的儀器設(shè)備狀態(tài)，必須保證在檢定或校準(zhǔn)有效期內(nèi)；考核前對(duì)儀器進(jìn)行簡(jiǎn)單維護(hù)，清洗離子源，做儀器校準(zhǔn)等，確保儀器能夠滿足實(shí)驗(yàn)靈敏度和穩(wěn)定性要求。

3.2 能力驗(yàn)證中質(zhì)量控制分析

3.2.1 同步做好質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室在做能力驗(yàn)證考核樣品的同時(shí)，應(yīng)做好質(zhì)量控制。質(zhì)量控制包括試劑空白、基質(zhì)空白和質(zhì)控樣品（添加回收）。試劑空白和基質(zhì)空白可用來(lái)確認(rèn)在檢測(cè)過程中所用到的試劑是否存在干擾或污染；若有干擾存在，在進(jìn)行定量結(jié)果計(jì)算時(shí)可以及時(shí)扣除，避免檢測(cè)結(jié)果偏高，超出能力驗(yàn)證判定標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控樣品可確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，同批次質(zhì)控樣品回收率滿足要求，考核樣品的檢測(cè)結(jié)果一般也會(huì)在允許的誤差范圍內(nèi)。

3.2.2 注意內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物的同步

能力驗(yàn)證考核樣品一般采用的是向空白基質(zhì)中添加目標(biāo)物的方式，制備好的樣品會(huì)放置一段時(shí)間后發(fā)放給各個(gè)參加考核的單位進(jìn)行檢測(cè)，而內(nèi)標(biāo)物是各個(gè)單位在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)自行添加的，這會(huì)使得內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物存在一定的時(shí)間差。為盡量減小兩者時(shí)間差帶來(lái)的影響，各檢測(cè)單位應(yīng)在接收樣品后充分解凍，加入內(nèi)標(biāo)物后，避光放置30～60 min，再按照規(guī)定的檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前處理，盡量使內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物狀況保持一致，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。

3.2.3 基質(zhì)效應(yīng)的消除

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除目標(biāo)分析物以外的組分，常對(duì)目標(biāo)物的分析有顯著的干擾，并影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾稱為“基質(zhì)效應(yīng)”。不同的基質(zhì)可能對(duì)目標(biāo)分析物產(chǎn)生增強(qiáng)或減弱效應(yīng)，因此在樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量時(shí)，可以選用空白基質(zhì)液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來(lái)減小基質(zhì)效應(yīng)的影響[11-12]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合使用Oasis PRiME HLB固相萃取凈化柱對(duì)實(shí)驗(yàn)前處理提取溶劑和凈化方式進(jìn)行改進(jìn)，優(yōu)化儀器檢測(cè)條件。結(jié)果表明該方法具有快速、簡(jiǎn)單易操作、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，并將該方法應(yīng)用于本次水產(chǎn)品中磺胺類藥物能力驗(yàn)證考核，取得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，通過本次考核實(shí)驗(yàn)，認(rèn)真總結(jié)了檢測(cè)過程中的注意事項(xiàng)及質(zhì)量控制技巧，使檢測(cè)人員的實(shí)驗(yàn)操作能力得到提升，同時(shí)也保證檢測(cè)機(jī)構(gòu)出具準(zhǔn)確、公正、有效的檢測(cè)數(shù)據(jù)，提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管水平，保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。