許晨霞 王德剛 張艷芳 鄭國兵 彭建明

廣東省中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東中山 528400

胎兒染色體非整倍體是常見的染色體數(shù)目異常，其中以三體型和單體型最為常見。最常見的染色體數(shù)目異常包括21 三體綜合征、18 三體綜合征、13 三體綜合征、三倍體和性染色體數(shù)目異常，如Klinefelter綜合征（47，XXY）、Jacobs 綜合征（47，XXX）、XYY 綜合征（47，XYY）和Turner 綜合征（45，X）等，約占產(chǎn)前診斷中染色體異常的80%[1]。通常有穿刺指征孕婦的胎兒染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)值較高，因此需要準(zhǔn)確性和特異性高的檢測手段，以減輕孕婦的焦慮情緒，并加快干預(yù)[1]。雖然染色體核型分析一直以來被認(rèn)為是診斷染色體非整倍體的金標(biāo)準(zhǔn)，但核型分析耗時(shí)耗力。QF-PCR 是一種高效、快速、可靠的產(chǎn)前非整倍體檢測方法[2-5]。然而，由于某些短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）標(biāo)記雜合度較低，這類產(chǎn)前樣本須進(jìn)一步細(xì)胞遺傳學(xué)分析或者加做雜合度較高STR的位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年9月至2021年7月在中山市博愛醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷的525 例穿刺樣本作為研究對(duì)象，年齡18～47 歲，平均（32.3±5.2）歲；孕齡12～33 周，平均（18.1±3.1）周；檢測標(biāo)本為絨毛28例，羊水421 例，臍血76 例。產(chǎn)前診斷指征主要包括頸部透明層（nuchal translucency，NT）增厚（≥3.0 mm）、唐氏血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、孕婦外周血胎兒游離DNA檢測高風(fēng)險(xiǎn)、超聲異常、夫妻雙方單基因遺傳病攜帶者等。進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦無手術(shù)禁忌證，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，孕婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

介入性產(chǎn)前診斷：按照傳代法細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片、G 顯帶進(jìn)行染色體核型分析，參照人類細(xì)胞基因組學(xué)國際命名體系（2016年）進(jìn)行命名。

主要儀器和試劑：多重STR 基因分型試劑盒（熒光PCR 毛細(xì)管電泳法）采購自廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，共20 個(gè)STR 位點(diǎn)，具體見表1。標(biāo)記熒光（FAM 為藍(lán)色熒光，HEX 為綠色熒光）。ABI PCR儀2720（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；ABI 基因分析儀3500Dx（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Lab-Aid820 核酸提取儀（廈門致善生物科技有限公司）；Pop7polymer，HiDi，SizeLizStandard600 均購LifeTechnology。

圖1 QF-PCR 試劑盒中13、18、21、X、Y 染色體上STR 位點(diǎn)擴(kuò)增序列的位置

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

QF-PCR 技術(shù)檢測步驟：按照操作規(guī)范進(jìn)行標(biāo)本采集、提取、擴(kuò)增、電泳及結(jié)果判斷。每批試驗(yàn)均設(shè)陰性、T21 的陽性對(duì)照，操作嚴(yán)格試劑盒說明書進(jìn)行。使用GeneMapper 5.0 軟件（Applied Biosystems）對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析并計(jì)算峰面積（峰面積為特定STR 峰下的面積）。①等位基因峰1 個(gè)，即單峰，可表示1 個(gè)拷貝或兩個(gè)及以上的純和拷貝，不用于結(jié)果判斷。②等位基因峰2 個(gè)，峰面積比值范圍分三種情況：異常峰型（三體峰型）為1.8～2.4 或0.45～0.65；正常峰型為0.8～1.4；不能判斷為正?；虍惓７逍图粗虚g范圍及1.4～1.8 或0.65～0.8，不用于結(jié)果判斷，當(dāng)該位點(diǎn)的判讀會(huì)影響結(jié)果判斷時(shí)，需重新檢測分析。③等位基因峰3 個(gè)，峰面積比接近1∶1∶1（最大峰面積與最小峰面積比值范圍為1～1.4），為異常峰型（三體峰型）。13、18、21 號(hào)染色體上的任意STR 位點(diǎn)中至少兩個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰，且峰面積比值范圍為0.8～1.4 為陰性。

2 結(jié)果

2.1 STR 標(biāo)記雜合度分析結(jié)果

13、18、21 及X 染色體的STR 標(biāo)記中雜合度最高分別為D13S742、D18S386、D 21S1414、DXS8377；雜合度最低的分別為D13S628、D18S391、D21S1433、DXS981（表1）。

表1 STR 標(biāo)記雜合度的QF-PCR 結(jié)果[n（%）]

2.2 STR 位點(diǎn)的峰型分析

檢測到18、21 三體中均存在4 例STR 標(biāo)記均為雙峰。檢測到的2 例18 號(hào)染色體B1～B4 的STR 標(biāo)記均為單峰。檢測到13、18、21 號(hào)染色體中分別有8、13、2 例STR 標(biāo)記僅一個(gè)1∶1 的雙峰，其余均為單峰（表2）。21 三體病例中A1-A6 的STR 標(biāo)記均為2∶1或者1:2 的雙峰（圖2，封三）。18 號(hào)染色體的STR 標(biāo)記均單峰的病例（圖3，封三）。13 號(hào)染色體的STR 標(biāo)記一個(gè)雙峰，其他位點(diǎn)為單峰（圖4，封三）。

表2 多重STR 分型結(jié)果（例）

圖2 21 號(hào)染色體A1-A6 的STR 標(biāo)記均為2∶1 或者1∶2 的雙峰

圖3 18 號(hào)染色體的STR 標(biāo)記均為單峰

圖4 13 號(hào)染色體的STR 標(biāo)記1 個(gè)雙峰，其他位點(diǎn)為單峰

2.3 QF-PCR 結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果比較

QF-PCR 檢測異常峰型三體型共27 例。QF-PCR結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果一致。將所有位點(diǎn)均為單峰、只有1 個(gè)雙峰其余位點(diǎn)均為單峰的樣本進(jìn)行G顯帶染色體核型，結(jié)果均為正常二倍體（表3）。

表3 QF-PCR 與染色體核型分析結(jié)果（例）

3 討論

本研究使用QF-PCR 試劑盒對(duì)525 例產(chǎn)前樣本檢測的診斷率為95%，其中有25 例產(chǎn)前樣本由于STR 位點(diǎn)均為單峰或者只有1 個(gè)雙峰而無法判讀。de Moraes 等[6]對(duì)162 個(gè)樣本進(jìn)行了研究，使用QFPCR 檢測的診斷率為97%。Tekcan 等[7]報(bào)道的診斷率為99%。由于STR 標(biāo)記存在群體差異，建議各標(biāo)記應(yīng)針對(duì)特定的群體進(jìn)行評(píng)估[8-10]。STR 位點(diǎn)的雜合度分析是QF-PCR 方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷染色體非整倍體檢測前的必要步驟[4，11]。為了在QF-PCR 非整倍體檢測中獲得可判斷的結(jié)果，選擇雜合度高的STR標(biāo)記是關(guān)鍵步驟。雜合度分析在臨床上對(duì)三體的診斷和染色體不分離的起源有重要意義[12]。本研究檢測中山地區(qū)的525 份產(chǎn)期樣本中13、18、21、X 和Y 染色體上20 個(gè)STR 標(biāo)記的雜合度數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，在13、18、21 號(hào)染色體的STR 標(biāo)記中，D13S742、D18S386、D21S1414 雜合度最高，這些雜合度高的STR 標(biāo)記能夠作為基因指紋區(qū)分每一個(gè)個(gè)體，而雜合度過低的STR 標(biāo)記則為非整倍體判讀帶來困難。使用含有更多其他STR 位點(diǎn)的試劑盒進(jìn)一步檢測可解決因STR 位點(diǎn)雜合度低而無法判讀的問題[13]。當(dāng)STR 位點(diǎn)均為單峰或者只有一個(gè)雙峰，其他位點(diǎn)均為單峰時(shí)，很難判斷該染色體該區(qū)域是否為兩個(gè)拷貝。本研究進(jìn)一步用G 顯帶染色體核型分析來確定了上述QF-PCR 結(jié)果無法判讀的病例均為正常二倍體。21 三體峰全部為雙峰，這類異常三體可能是由于高齡母親生殖細(xì)胞在有絲分裂期間染色體不分離產(chǎn)生[14]。

有研究表明只要缺失或者重復(fù)區(qū)域包含了試劑盒設(shè)計(jì)的相鄰兩個(gè)STR 位點(diǎn)，檢測結(jié)果將提示該STR 位點(diǎn)存在缺失或者重復(fù)[15-18]。當(dāng)設(shè)計(jì)的STR 位點(diǎn)在染色體上距離較遠(yuǎn)時(shí)，無法得到缺失重復(fù)區(qū)域的范圍大小，甚至缺失和重復(fù)區(qū)域在兩個(gè)STR 位點(diǎn)之間時(shí)可能被漏檢。本研究結(jié)果提示當(dāng)研發(fā)QF-PCR 標(biāo)記時(shí)，選擇的STR 位點(diǎn)應(yīng)該在整條染色體上均勻分布，且盡量選擇雜合度高的STR 標(biāo)記，可以根據(jù)該異常STR 標(biāo)記定位到染色體的具體位置上。產(chǎn)前檢測試劑盒設(shè)計(jì)時(shí)既要在13、18、21 及性染色體的上找到雜合度高的STR 標(biāo)記，又應(yīng)該考慮到STR 位點(diǎn)在該條染色體上均勻分布。QF-PCR 與核型分型結(jié)果一致，靈敏度高，效率高，本研究支持QF-PCR 方法用于產(chǎn)前檢測。