喻晶晶， 肖 巍， 李婭妮， 張必翔， 陳孝平， 舒 暢

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 肝臟外科中心， 武漢 430000

肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，在常見的惡性腫瘤中，肝癌發(fā)病率位居全國第五，死亡率居第二，據(jù)估測每年新發(fā)肝癌病例46萬例，5年相對生存率僅為12.1%。肝癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展與多種危險因素相關(guān)，如病毒性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、黃曲霉素等。目前，治療肝癌的最有效方法為手術(shù)切除，早期診斷和治療是提高手術(shù)療效的關(guān)鍵[1-4]。因此，開發(fā)早期檢測工具和創(chuàng)新型靶向藥物是提升早期診斷準(zhǔn)確度、增強(qiáng)肝癌臨床治療效果的有效途徑，目前相關(guān)研究主要集中在：(1)發(fā)現(xiàn)提高早期預(yù)測和診斷能力的精準(zhǔn)生物標(biāo)志物；(2)揭示肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因及信號通路；(3)藥物研發(fā)的潛在分子機(jī)制分析及藥品有效性、安全性評估；(4)個體化精準(zhǔn)治療方案的探索。上述研究均需建立在高質(zhì)量的人體生物樣本的采集、保存及管理之上。

生物樣本庫作為病因?qū)W研究的重要資源平臺，其在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究邁向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的過程中發(fā)揮了重要作用。近年來，隨著醫(yī)學(xué)研究對高質(zhì)量生物樣本的迫切需求，不同類型的人類生物樣本庫建設(shè)在世界各大醫(yī)學(xué)院、醫(yī)療機(jī)構(gòu)中獲得快速發(fā)展。早期國際上出現(xiàn)的英國生物樣本庫、泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心及美國國家癌癥研究所下屬的生物樣本庫和生物樣本研究分會等，均為疾病的病因?qū)W研究提供了可靠的樣本資源。我國生物樣本庫在國家醫(yī)學(xué)科技發(fā)展規(guī)劃下得到了跨越式發(fā)展，涌現(xiàn)了一批以人口為導(dǎo)向和以疾病為導(dǎo)向的不同類型的生物樣本庫。其中，以疾病為導(dǎo)向的臨床生物樣本庫由于其復(fù)雜性，通常起源于醫(yī)療機(jī)構(gòu)，建立在醫(yī)院內(nèi)部，有自己獨(dú)立的操作空間和管理制度[5-7]。該類型臨床生物樣本庫目前已有廣泛的應(yīng)用，例如以腫瘤為主的生物樣本庫、特殊疾病生物樣本庫等，這些樣本庫均為相關(guān)研究提供了重要樣本資源[8-13]。

2012年以前，同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科肝癌相關(guān)研究的臨床樣本根據(jù)課題的不同需求，由各課題組成員分別完成采集、保存和管理工作，操作流程與要求不一致，樣本質(zhì)量參差不齊，臨床數(shù)據(jù)與隨訪信息也缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，利用率較低。2012年，同濟(jì)醫(yī)院正式組建了生物樣本庫與生物資源研究中心，聚焦肝癌樣本的采集、保存與管理，為國家重大科技專項“病毒性肝炎相關(guān)肝癌樣本庫的建設(shè)維護(hù)及基線水平調(diào)查”的研究提供了強(qiáng)有力支撐。本文主要總結(jié)了2012年—2020年肝臟外科生物樣本庫樣本儲存情況，根據(jù)采集、保存、出入庫及信息管理等流程，制定標(biāo)準(zhǔn)化操作制度和信息化管理措施，并對已入庫保存的冷凍樣本質(zhì)量進(jìn)行評估，擬構(gòu)建一個合格的生物資源研究平臺，為肝癌研究提供高質(zhì)量的臨床樣本和臨床數(shù)據(jù)信息。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究的所有樣本來源于2012年8月—2020年12月就診于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肝臟外科的肝癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前影像學(xué)診斷為肝癌；(2)擬進(jìn)行腹腔鏡切除術(shù)或開腹手術(shù)；(3)術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后病理診斷為良性腫瘤或非肝癌的惡性腫瘤；(2)其他腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟的轉(zhuǎn)移性癌。排除后的樣本將納入其他疾病樣本庫。

1.2 儀器設(shè)備 -80 ℃超低溫冰箱(DW-86L626，海爾，青島)，雙門及多門電冰箱(KK18V011CW，西門子，中國)，液氮罐(CY509111CN，Thermo，美國)，低溫標(biāo)簽打印機(jī)(IP300，Brady，美國)，冰箱無線溫度監(jiān)控系統(tǒng)(YB-HC004-00，海爾，青島)，二氧化碳后備系統(tǒng)(BZ07A0B01，海爾，青島)，生物樣本庫管理系統(tǒng)(BIMS，海爾，青島)，生物安全柜(HFsafe-1200A2，力康，上海)，低速離心機(jī)(L500，湘儀，湖南)，高通量組織研磨器(18-G136，新芝，寧波)，生物組織包埋機(jī)(EG1160，LEICA，德國)，石蠟切片機(jī)(RM2235，LEICA，德國)，脫水機(jī)(TP1020，LEICA，德國)，微量紫光分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo，美國)。

1.3 樣本的采集及處理

1.3.1 血液的采集及處理 對符合納排標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后外周血樣本的采集，用促凝管和抗凝管分別采集外周血各5 mL，顛倒混勻，其中促凝管3200 r/min離心10 min，置于超凈工作臺中分離血清；抗凝管全血直接分裝，-80 ℃凍存。

1.3.2 組織的采集及處理 (1)新鮮組織：對符合納排標(biāo)準(zhǔn)的患者在不影響病理診斷所需材料的前提下，進(jìn)行新鮮組織樣本的采集，盡量采集未壞死癌組織，癌旁組織選擇距離癌灶邊緣3 cm處的組織樣本，遠(yuǎn)癌組織選擇距癌灶邊緣5 cm以上或距離癌灶邊緣最遠(yuǎn)端(或手術(shù)切緣處)的組織樣本，并對樣本進(jìn)行拍攝及標(biāo)注位置。組織樣本的量一般不少于200 mg，其中一份樣本加入RNALater保護(hù)液，樣本切除后迅速置于液氮中保存，整個取樣過程盡量在手術(shù)樣本離體后30 min內(nèi)完成。(2)石蠟包埋組織：取材操作規(guī)范同新鮮組織，取材部位包括癌灶、癌與癌旁交界處、癌灶周圍3 cm處的癌旁組織和5 cm以外的遠(yuǎn)癌組織。取材以癌灶為中心水平向兩側(cè)取材，盡量保證足夠大的組織樣本。取材以“遠(yuǎn)癌-癌旁-癌與癌旁交界處-癌灶”的順序，所有組織塊進(jìn)行拍攝且標(biāo)明取材部位，最后用中性福爾馬林溶液固定。固定后的組織經(jīng)過“取材-脫水-透明-浸蠟-包埋”過程之后，完成組織樣本的石蠟包埋。

1.3.3 糞便的采集及處理 本研究收集患者術(shù)前、術(shù)后的糞便，用取便器采集患者樣本后，將樣本置于超凈工作臺中進(jìn)行分裝，每份1～2 g。其中兩份加入1.5 mL 20%無菌甘油，含2顆小鋼珠，60 Hz 60 s震蕩混勻后，吸至凍存管-80 ℃凍存；另外兩份直接-80 ℃凍存。

1.4 樣本的保存 血液、新鮮組織及糞便樣本完成采集與處理后，分裝至若干個Ep管進(jìn)行低溫入庫儲存。通過生物樣本庫管理系統(tǒng)(BIMS)注冊患者基本信息，并關(guān)聯(lián)對應(yīng)樣本信息，打印標(biāo)簽條貼至各Ep管，放置于-80 ℃冰箱對應(yīng)位置保存。每臺-80 ℃冰箱都配有無線溫度監(jiān)控系統(tǒng)和二氧化碳后備系統(tǒng)，可設(shè)置低溫預(yù)警提示，以保證樣本低溫環(huán)境的穩(wěn)定性。石蠟包埋組織同樣進(jìn)行標(biāo)簽與分類后，放置于石蠟柜室溫保存。

1.5 臨床數(shù)據(jù)采集及隨訪跟蹤 患者臨床數(shù)據(jù)的采集主要通過本院電子病歷系統(tǒng)完成，包括患者從門診到住院的所有信息，數(shù)據(jù)的內(nèi)容主要是基本信息(年齡、性別、BMI等)、既往史(飲酒、吸煙、肥胖等)、基礎(chǔ)肝病(肝硬化、病毒性肝炎、脂肪肝、血吸蟲、門靜脈高壓等)、肝功能(Alb、ALT、AST、TBil、PTA、膽固醇、膽汁酸等)、影像學(xué)診斷(B超、CT、磁共振等)、治療手段及方法(腹腔鏡、開腹、切除范圍、阻斷方式等)、腫瘤特性(Child分級、BCLC分期、TNM分期、腫瘤標(biāo)志物等)及術(shù)后并發(fā)癥(腹水、胸水、肝衰竭、腹腔感染等)。定期進(jìn)行患者的追蹤隨訪工作，主要通過電話隨訪和門診隨訪兩種形式。

1.6 樣本質(zhì)量控制與檢測 根據(jù)樣本入庫時間，隨機(jī)抽取不同年份的肝癌及癌旁冷凍組織樣本，進(jìn)行總RNA的提取及檢測。按照試劑盒說明書完成RNA的提取，NanoDrop檢測其濃度，Agilent 5400檢測其完整性和純度。

1.7 樣本的管理及使用 保存好的樣本在完成病歷錄入和跟蹤隨訪后，即可投入使用。樣本庫有專門的管理小組，負(fù)責(zé)審批樣本使用權(quán)限。各研究小組成員如需使用樣本庫樣本，使用者需向樣本庫管理小組提交申請，管理小組審核批準(zhǔn)后，交由工作人員查詢所需患者ID，找到對應(yīng)樣本位置信息，完成樣本的出庫。樣本的出入庫都在低溫環(huán)境中進(jìn)行。樣本出庫進(jìn)入研究項目后，若研究結(jié)束時樣本全部用完，則需告知工作人員對該樣本進(jìn)行注銷，若存在剩余樣本則需歸還再次入庫保存。

2 結(jié)果

2.1 樣本收集情況 2012年8月—2020年12月樣本庫共收集4190例肝癌手術(shù)患者樣本，其中包括41 718份冷凍組織樣本、18 950份石蠟包埋組織樣本、24 389份全血樣本、20 060份血清樣本和5392份糞便樣本。所收集肝癌患者的年齡范圍為13～88歲；男性占比85.1%；66.7%的患者無飲酒史；乙型肝炎和肝硬化的比例較高，分別為83.3%和73.5%；11.5%的患者伴門靜脈高壓癥(表1)。

表1 樣本庫肝癌患者基礎(chǔ)信息表

2.2 標(biāo)準(zhǔn)化操作流程的建立 樣本庫具有獨(dú)立的工作空間，共設(shè)置6個工作區(qū)域：樣本處理區(qū)、樣本出入庫管理區(qū)、臨床數(shù)據(jù)庫及隨訪區(qū)、質(zhì)檢實驗區(qū)、-80 ℃樣本冷凍區(qū)和液氮冷凍區(qū)。本庫配備6名專職人員，冷凍區(qū)實現(xiàn)實時監(jiān)控。根據(jù)樣本的收集、處理、保存、管理及應(yīng)用，制定出一份標(biāo)準(zhǔn)的操作流程(standard operating procedure，SOP)(圖1)。

圖1 肝癌樣本庫SOP

2.3 樣本質(zhì)量檢測 從樣本庫保存的冷凍組織樣本中，隨機(jī)挑選出2012年—2020年的肝癌及癌旁組織樣本18份，提取總RNA。檢測結(jié)果為A的16份樣本RNA濃度及完整性均達(dá)到高質(zhì)量等級，能夠滿足后續(xù)PCR、轉(zhuǎn)錄組測序等實驗需求；2份癌組織樣本檢測結(jié)果為C，主因RNA的完整度不足，說明其質(zhì)量處于中等級別，可能會影響后續(xù)實驗的進(jìn)行(表2)?？傮w上，樣本庫組織樣本保存質(zhì)量較高，少數(shù)保存時間較長的癌組織中RNA可能發(fā)生降解，從而影響了檢測結(jié)果。

表2 肝癌組織樣本RNA檢測結(jié)果

2.4 信息化數(shù)據(jù)查詢及管理 為實現(xiàn)各版塊數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)，樣本庫建立了一套電子數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(electronic data capture system，EDC)(圖2)，將從電子病歷系統(tǒng)中采集的患者信息、樣本出入庫系統(tǒng)的樣本信息和隨訪信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)，實現(xiàn)模糊查詢關(guān)聯(lián)信息功能，并標(biāo)注納入不同研究項目的患者及所用樣本，方便使用者查詢樣本的應(yīng)用情況。

圖2 肝癌樣本庫信息管理系統(tǒng)

3 討論

本科室肝癌生物樣本庫的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)與信息化管理為樣本質(zhì)量提供了有力保障，也充分挖掘了樣本的科研價值，支撐本科室承擔(dān)的多個國家級課題順利推進(jìn)，在國內(nèi)外高水平期刊上發(fā)表數(shù)篇文章[14-17]。其中Song等[14]通過檢測樣本庫的肝癌組織，發(fā)現(xiàn)分子伴侶蛋白14-3-3σ在癌組織中表達(dá)增高，高表達(dá)的14-3-3σ與肝癌侵襲性臨床病理特征和預(yù)后不良相關(guān)。深入研究表明，14-3-3σ通過抑制表皮生長因子受體降解從而激活依賴表皮生長因子受體的ERK1/2信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的逃避失巢凋亡效應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移。Liao等[15]在樣本庫肝癌組織樣本中發(fā)現(xiàn)pSMAD3/SMAD3與PTPRε表達(dá)呈正相關(guān)，且SMAD3或PTPRε高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)。本文還揭示了TGFβ/SMAD3和PTPRe之間的正反饋調(diào)節(jié)，為肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的研究思路及治療靶點。

但本樣本庫也存在一些問題，有待進(jìn)一步加強(qiáng)改進(jìn)和完善。本樣本庫建設(shè)面積200平方米，屬于以疾病為導(dǎo)向的小型生物樣本庫，服務(wù)對象主要是本科室醫(yī)生、科研人員和學(xué)生，受利面較窄，尚未實現(xiàn)與其他樣本庫的樣本與信息的共建共享。因本科室近年承擔(dān)的肝癌與腸道菌群關(guān)系研究的課題需要，本庫增加了糞便樣本的采集與保藏工作，但由于采集啟動時間較晚且人員配置不足，樣本量不大，今后需進(jìn)一步增加人員配備，豐富樣本庫樣本的種類與數(shù)量，為后續(xù)課題研究提供堅實數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

在患者病歷信息的采集方面，還存在一些漏項，主要原因是電子病歷系統(tǒng)填寫不詳實，需進(jìn)一步加強(qiáng)與臨床醫(yī)生間的緊密聯(lián)系，及時查詢?nèi)霂鞓颖緛碓椿颊叩碾娮硬v，確保入庫樣本來源患者相關(guān)臨床信息的完整準(zhǔn)確性，為后續(xù)隨訪信息收集等工作奠定基礎(chǔ)。

衡量樣本庫樣本保存質(zhì)量的核心指標(biāo)之一是凍存樣本的RNA檢測，從本次檢測結(jié)果來看，本樣本庫凍存7年內(nèi)(2014年—2020年)的樣本質(zhì)量較高，占本次檢測總量的77.8%，可滿足肝癌研究的要求；凍存7年以上(2012年—2013年)的部分組織樣本存在RNA降解的問題，占本次檢測總量的11.1%，質(zhì)量較差，無法完全滿足肝癌研究的要求。在今后的樣本利用中，應(yīng)進(jìn)一步加快樣本利用效率，在樣本采集入庫后，盡快應(yīng)用到各項課題研究中去。

工作人員的專業(yè)性是保障樣本庫持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，本樣本庫專職人員均持有相關(guān)合格證書，并不定期參加國內(nèi)生物樣本庫相關(guān)會議培訓(xùn)，據(jù)統(tǒng)計，2012年—2020年參加相關(guān)會議培訓(xùn)54人次。隨著國內(nèi)外研究者對生物樣本庫關(guān)注度的不斷提升，新一代信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)與生物、醫(yī)療技術(shù)的迭代升級，生物樣本庫建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)正處在不斷更新提檔的快速發(fā)展期，在樣本收集、儲藏、運(yùn)輸、分配、檢索、倫理、信息和安全等方面都產(chǎn)生了一系列規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)[18-20]，客觀上要求樣本庫專職人員必須不斷學(xué)習(xí)，接受專業(yè)培訓(xùn)，提升樣本庫建設(shè)與管理標(biāo)準(zhǔn)，努力建設(shè)成為服務(wù)肝臟基礎(chǔ)科研的高效生物資源研究平臺。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年7月28日經(jīng)由同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會審批，批號：TJ-IRB20210760?；颊呔炇鹬橥鈺?。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：喻晶晶參與研究的實施、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析及文章的撰寫；肖巍、李婭妮對研究的完成有關(guān)鍵貢獻(xiàn)；張必翔負(fù)責(zé)指導(dǎo)研究思路和論文框架；陳孝平、舒暢參與研究方案的設(shè)計、文章的修訂及定稿。