曾 湛， 高媛嬌， 畢瀟月， 陳鳳欣， 鄧 雯， 蔣婷婷， 林妍潔， 楊 柳，李明慧，， 謝 堯，

1 北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院 肝病二科， 北京 100015； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 肝病二科， 北京 100015

據(jù)2016年世衛(wèi)組織公布的研究[1]顯示，目前全世界范圍內(nèi)約有2.57億人患有慢性乙型病毒性肝炎(CHB)，目前認(rèn)為慢性HBV感染的自然史分為5個(gè)階段：HBeAg陽(yáng)性的慢性感染、HBeAg陽(yáng)性的慢性肝炎、HBeAg陰性的慢性感染、HBeAg陰性的慢性肝炎、HBsAg陰性階段[2]。免疫耐受期指的是HBeAg陽(yáng)性的慢性感染階段，這個(gè)階段的臨床特點(diǎn)是高病毒載量、轉(zhuǎn)氨酶正常、無(wú)明顯肝臟炎癥壞死和纖維化[3]，其中無(wú)明顯肝臟炎癥壞死和纖維化是判斷免疫耐受的最重要依據(jù)，然而在實(shí)際臨床中，部分轉(zhuǎn)氨酶正常且高病毒載量的患者卻已經(jīng)存在著肝臟炎癥壞死或纖維化的情況[4]，如果僅以轉(zhuǎn)氨酶、病毒量作為診斷依據(jù)，很有可能會(huì)漏判一部分肝炎患者，從而延誤了治療時(shí)機(jī)。本研究的目的是探索ALT正常且高病毒載量的HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者人群的肝炎發(fā)生情況及預(yù)測(cè)因素，以期為臨床診斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究臨床注冊(cè)號(hào)為NCT04032275?；仡櫺赃x取2008年10月—2015年5月在北京地壇醫(yī)院進(jìn)行肝穿刺活檢的HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者，按照標(biāo)準(zhǔn)篩選分組完成后對(duì)收集資料進(jìn)行對(duì)比分析，同時(shí)研究肝炎發(fā)生的預(yù)測(cè)因素。高病毒載量定義為HBV DNA≥2×107IU/mL[3]，根據(jù)肝穿刺活檢病理結(jié)果來(lái)判斷是否存在炎癥[3]，即G≥1或者S≥1則定義為肝炎。

1.2 患者篩選 入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBsAg持續(xù)陽(yáng)性6個(gè)月以上；(2)HBeAg陽(yáng)性；(3)既往從未接受過(guò)HBV抗病毒治療；(4)患者同意入組。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者ALT>40 U/L或HBV DNA<2×107IU/mL；(2)合并其他病毒性肝炎(如甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎)或慢性肝病(如酒精性肝病、脂肪性肝病、自身免疫性肝病)。分組標(biāo)準(zhǔn)：肝穿刺提示≤G1且≤S1的患者歸為無(wú)肝炎組，將>G1或>S1的歸為肝炎組(即有肝組織損傷或纖維化)。

1.3 收集資料 收集患者性別、年齡、肝穿刺活檢結(jié)果(G表示肝臟炎癥程度，S表示纖維化程度)以及做肝穿刺活檢前后2周內(nèi)的檢驗(yàn)結(jié)果，包括ALT、AST、TBil、Alb、WBC、PLT、PTA、HBsAg定量log值、HBeAg、HBV DNA定量log值。

1.4 血清學(xué)檢測(cè) 采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法(檢測(cè)試劑來(lái)自美國(guó)雅培公司)對(duì)HBsAg和HBeAg進(jìn)行檢測(cè)，HBsAg動(dòng)態(tài)范圍為0.05～250 U/mL。HBsAg濃度為>250 U/mL的樣品稀釋至1∶500后進(jìn)行計(jì)算獲得具體濃度。HBeAg陽(yáng)性定義為>1樣品/截止值(S/CO)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 收集HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者共1037例，排除ALT>40 U/L者674例，排除HBV DNA<2×107IU/mL者180例，最后剩余183例符合入組標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)病理結(jié)果得知無(wú)肝炎組占79.8%(146/183)，肝炎組占20.2%(37/183)。在有肝炎的37例中，肝穿刺提示G1S2者5.4%(2/37)、G2S1者70.3%(26/37)、G2S2者18.9%(7/37)、G3S1者2.7%(1/37)、G3S2者2.7%(1/37)。

2.2 肝炎組與無(wú)肝炎組基線情況對(duì)比 對(duì)比無(wú)肝炎組和肝炎組患者的基線數(shù)據(jù)情況，兩組患者間ALT水平并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，對(duì)ALT按照<20、20～29.9、30～40 U/L進(jìn)行分層后再進(jìn)一步組間比較，結(jié)果仍無(wú)顯著性差異(P值均>0.05)。肝炎組患者的AST水平顯著高于無(wú)肝炎組患者(P=0.001) ，男性比例顯著低于無(wú)肝炎組患者(P=0.011)，HBsAg水平顯著低于無(wú)肝炎組患者(P=0.029)。余指標(biāo)未見(jiàn)顯著性差異(表1)。

表1 肝炎組與無(wú)肝炎組基線情況對(duì)比

2.3 肝炎發(fā)生危險(xiǎn)因素 將肝炎發(fā)生與否作為因變量，年齡、性別、ALT、AST、TBil、Alb、WBC、PLT、PTA、HBV DNA、HBsAg、HBeAg做為自變量進(jìn)行二元logistics回歸，單因素分析顯示，年齡、性別、AST、HBsAg、HBeAg有顯著性差異(P值均<0.05)(表2)，將5個(gè)因素以后退法進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示HBsAg是肝臟炎癥的危險(xiǎn)因素(OR=0.077，95%CI：0.009～0.630，P=0.017)。

表2 單因素logistic回歸分析肝炎危險(xiǎn)因素

2.4 ROC曲線分析 HBsAg定量log值ROC下面積為0.667，P=0.032，計(jì)算約登指數(shù)為0.276，此數(shù)值下的敏感度為0.824，特異度為0.452，截?cái)嘀禐?.53，即HBsAg=33 884.4 IU/mL(圖1)。

圖1 HBsAg定量log值的ROC曲線

鑒于AST在兩組基線對(duì)比中的差異和單因素logistics回歸的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，單獨(dú)對(duì)AST行ROC曲線分析并計(jì)算截?cái)嘀?，結(jié)果顯示曲線下面積為0.678，P=0.032，計(jì)算約登指數(shù)為0.309，此數(shù)值下的敏感度為0.405，特異度為0.904，截?cái)嘀禐?8.45(圖2)。

圖2 AST的ROC曲線圖

2.5 美國(guó)肝病學(xué)會(huì)(AASLD)乙型肝炎指南診斷標(biāo)準(zhǔn)下肝炎發(fā)生情況 2018版AASLD乙型肝炎指南里對(duì)ALT正常范圍的定義為男性≤35U/L，女性≤25U/L，在本研究的183例患者中，有122例符合標(biāo)準(zhǔn)。這122例患者中有102例(83.6%)肝穿刺提示不存在肝炎，余61例中有17例(27.9%)提示存在肝炎。比較國(guó)內(nèi)指南標(biāo)準(zhǔn)下和AASLD指南標(biāo)準(zhǔn)下判斷兩組患者免疫耐受準(zhǔn)確率的差異，結(jié)果提示兩者比較不存在顯著性差異(79.8%% vs 83.6%,χ2=0.705,P=0.401)。

3 討論

HBV本身不會(huì)造成肝細(xì)胞的損傷，肝細(xì)胞的損傷是由HBV引起的免疫應(yīng)答造成的，隨著感染者免疫狀態(tài)的改變，慢性感染者的耐受狀態(tài)打破隨即進(jìn)入清除期，這也是轉(zhuǎn)氨酶升高的原因，但是由于樹(shù)突狀細(xì)胞和HBV特異性T淋巴細(xì)胞的功能障礙，HBV無(wú)法從人體中徹底清除，HBsAg的大量存在也會(huì)抑制免疫功能導(dǎo)致感染持續(xù)，這也是肝炎持續(xù)存在和反復(fù)發(fā)生的原因[3,5]。

HBeAg陽(yáng)性的慢性感染在HBV感染的自然病程中等同于以往分期中的免疫耐受期[6]。我國(guó)2019年更新的乙型肝炎指南提示，免疫耐受期具有以下特點(diǎn)，HBsAg陽(yáng)性且>10 000 IU/mL，HBeAg陽(yáng)性、抗-HBc陽(yáng)性、HBV DNA>2×107IU/mL、ALT≤40 U/L[3]，但是滿足以上條件并不意味著一定處于免疫耐受狀態(tài)，診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是肝穿刺活檢，免疫耐受期患者的肝組織病理學(xué)檢查無(wú)明顯炎癥壞死或纖維化。然而肝穿刺活檢是有創(chuàng)性檢查，臨床上難以廣泛實(shí)施，因此希望能夠通過(guò)無(wú)創(chuàng)性的檢驗(yàn)來(lái)提高病程診斷的準(zhǔn)確度。對(duì)于打破了免疫耐受狀態(tài)的患者，要及時(shí)予以治療[7]，ALT升高可能是改善預(yù)后的治療時(shí)機(jī)[8]，而是否應(yīng)該積極治療仍處在免疫耐受期的患者，則眾說(shuō)紛紜，有研究[9-10]表明ALT正常的高病毒載量患者發(fā)展成為肝癌的風(fēng)險(xiǎn)也相對(duì)較高，因此應(yīng)該進(jìn)行抗病毒治療降低病毒載量；但是也有學(xué)者認(rèn)為免疫耐受期進(jìn)行治療難以取得可觀的療效，所以定期復(fù)查即可[11-13]?；诖?，本研究探索ALT正常且高病毒載量的HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者人群的肝炎發(fā)生情況及預(yù)測(cè)因素，以期為臨床診斷提供參考依據(jù)。

本研究中滿足大三陽(yáng)、HBV DNA>2×107IU/mL、ALT≤40 U/L的患者有183例，但是分析了這部分患者的肝臟病理結(jié)果后，只有79.8%的患者滿足無(wú)明顯炎癥壞死或纖維化，也就是說(shuō)診斷免疫耐受的準(zhǔn)確率只有79.8%。在其他學(xué)者的研究中，也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的情況，比如Chi等[14]關(guān)于免疫耐受期的雙中心前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，在ALT≤40 U/L、HBeAg陽(yáng)性、HBV DNA≥5 logIU/mL患者中，只有31%的患者肝穿活檢提示無(wú)明顯炎癥壞死或纖維化；Kumar等[4]以同樣的標(biāo)準(zhǔn)分組的患者中，有60.3%的患者活檢提示無(wú)明顯纖維化。由此可見(jiàn)，即便滿足ALT正常、高病毒載量、HBeAg陽(yáng)性等條件，仍然有部分患者存在著肝臟炎癥，如果不及時(shí)干預(yù)，肝炎的持續(xù)就可能會(huì)導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生[15]。

ALT是反映肝臟炎癥的敏感指標(biāo)，但是在本研究中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肝炎組和無(wú)肝炎組患者之間ALT的差異，即使在分層比較之后，也未見(jiàn)到顯著性差異。雖然如此，AST卻在比較中發(fā)現(xiàn)了顯著性差異的存在，這提示，在ALT無(wú)法判斷肝臟炎癥的時(shí)候，AST或許是一個(gè)值得關(guān)注的指標(biāo)。在Chi等[14]研究中就發(fā)現(xiàn)AST可以作為預(yù)測(cè)肝臟炎癥的預(yù)測(cè)因素。因此盡管在多因素logistic回歸中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AST可以作為預(yù)測(cè)因素，本研究仍對(duì)AST單獨(dú)行單因素logistic回歸和繪制ROC曲線，并求得截?cái)嘀禐?8.45 U/L，AST位于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，ALT位于肝細(xì)胞質(zhì)中，AST的升高或許表明肝臟存在慢性炎癥[16]。HBV DNA能直接反映病毒在人體的活躍程度，人體對(duì)病毒的免疫激活會(huì)在一定程度上清除HBV DNA，使其載量下降，但是在本研究中，肝炎組和無(wú)肝炎組的患者之間HBV DNA載量無(wú)顯著差異，這可能與在制訂入組標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，只納入了HBV DNA>2×107IU/mL的患者有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg是肝臟炎癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HBsAg是由HBV的Dane顆粒和病毒亞顆粒組成，具有抑制人體免疫的作用，能夠同時(shí)抑制人體的固有免疫和特異性免疫[17]， 肝炎的發(fā)生意味著免疫耐受的打破，其中涉及到多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子，Li等[18]發(fā)現(xiàn)，HBsAg與IL-10、IL-6、IFNα等細(xì)胞因子明顯的相關(guān)關(guān)系，因此HBsAg的變化趨勢(shì)可以用于預(yù)測(cè)抗病毒治療的效果和預(yù)后[19-20]，此外HBsAg的消失能夠最大程度降低肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[21-22]。 此前Chan等[23]的一項(xiàng)長(zhǎng)時(shí)間隊(duì)列觀察研究發(fā)現(xiàn)，較低水平的HBsAg可以在一定程度上反映免疫清除，但是他們的研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一個(gè)HBsAg截?cái)嘀悼梢杂脕?lái)判斷是否存在免疫清除。在本研究中發(fā)現(xiàn)HBsAg的截?cái)嘀禐?3 884.4 IU/mL，盡管特異度只有0.452，但是在臨床工作中也可以作為醫(yī)者診斷的一個(gè)提示。

目前我國(guó)指南與AASLD指南對(duì)于轉(zhuǎn)氨酶正常的定義有所不同[3,15]，因此筆者也根據(jù)AASLD的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，結(jié)果提示，盡管在AASLD的標(biāo)準(zhǔn)下診斷免疫耐受的準(zhǔn)確率稍高于我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，但是其差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此我國(guó)對(duì)ALT的上限值制訂符合我國(guó)人群，診斷效果與AASLD無(wú)顯著性差異。

在無(wú)法進(jìn)行肝組織病理檢查的情況下，尋找其他無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)來(lái)判斷肝臟炎癥存在與否就顯得尤為重要，本研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)生肝炎與未發(fā)生肝炎患者的基線性別比例、AST和HBsAg都存在著顯著差異，進(jìn)一步進(jìn)行回歸分析后發(fā)現(xiàn)HBsAg是預(yù)測(cè)肝炎發(fā)生與否的可靠指標(biāo)，臨床上應(yīng)著重關(guān)注血清HBsAg低于33 884.4 IU/mL的患者后續(xù)檢查結(jié)果的變化，及時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶的異常，必要時(shí)可以進(jìn)行肝穿刺活檢以明確病程指導(dǎo)治療。

當(dāng)然，本研究尚存在著一定的不足，183例的樣本量可能存在一定的偏差，但這是本研究橫斷面數(shù)據(jù)的真實(shí)展現(xiàn)，在今后的研究中筆者可以增加中心和擴(kuò)充樣本量來(lái)糾正偏差，有待以后進(jìn)行前瞻性研究進(jìn)行深入探討。更大樣本的數(shù)據(jù)分析或許能夠發(fā)現(xiàn)更多預(yù)測(cè)指標(biāo)，其他學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)抗-HBc、HBV DNA載量、ALT等可能也是肝炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素[13,24]；此外對(duì)患者的檢查沒(méi)有進(jìn)行多時(shí)間點(diǎn)的分析，無(wú)法確定入組患者中是否存在有轉(zhuǎn)氨酶間斷異常波動(dòng)的情況，后續(xù)有待納入更多患者擴(kuò)充樣本量，同時(shí)收集多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的檢查結(jié)果，以進(jìn)行更全面的分析研究。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2018年1月25日經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)北京地壇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：201800201。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：謝堯、李明慧對(duì)研究思路和研究設(shè)計(jì)有關(guān)鍵貢獻(xiàn)；陳鳳欣、鄧雯、蔣婷婷、林妍潔、楊柳收集和分析數(shù)據(jù)；高媛嬌、畢瀟月參與研究統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的選擇和文章的修改；曾湛負(fù)責(zé)撰寫(xiě)成文。