馬 兵，張麗紅，趙 丹，李月賢，尹婉宜，沈 揚

河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院 血液內科，河北 石家莊 050031

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)為臨床常見的血液系統(tǒng)疾病，盡管疾病的性質不盡相同，但均可引發(fā)骨髓造血衰竭[1]。MDS是一組起源于骨髓造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病，環(huán)孢素和抗胸腺細胞球蛋白等免疫抑制劑對30%～60%患者治療有效[2]。AML也屬于造血干細胞/祖細胞惡性克隆性疾病，但其僅可通過放療/化療產(chǎn)生療效[3]。目前，臨床對于AML、MDS的免疫系統(tǒng)變化，T淋巴細胞介導的細胞免疫是否具有差異，以及AML與MDS為不同分期還是同一種疾病仍缺乏權威性的說明。Th17是一群在白細胞介素(interleukin，IL)-6等細胞因子和TCR通路刺激下分化的細胞亞群。Treg細胞是一種細胞群，可以對機體細胞免疫進行調控，維持免疫系統(tǒng)對自身成分的耐受，使機體維持良好的免疫穩(wěn)態(tài)[4]。有研究報道，Treg細胞和Th17細胞的平衡在同種異體胎兒免疫、器官移植、腫瘤及感染等疾病方面對各種途徑的病理生理免疫應答具有一定的抑制作用[5]。本研究旨在探討AML、MDS患者Th17、IL-21及IL-1β水平變化及臨床意義。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將自2016年1月至2020年12月河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院收治的20例AML患者納入AML組，30例MDS患者納入MDS組。將MDS組中難治性貧血原始細胞增多(myelodysplasticsyndrome-refractory anemia with excessblasts，MDS-RAEB)患者納入MDS-RAEB亞組(n=15)，難治性貧血(myelodysplasticsyndrome-refractory anemia，MDS-RA)患者納入MDS-RA亞組(n=15)?；颊呔舷嚓P血液病的診斷標準[6-7]，且排除心肝腎功能障礙者，排除惡性腫瘤及嚴重器質性消耗性疾病者。另選取同期于我院體檢的20例健康者納入對照組。AML組中，男性13例，女性7例；年齡40～71歲，平均年齡(58.69±3.18)歲；平均病程(2.39±0.32)個月。MDS組中，男性17例，女性13例；年齡41～72歲，平均年齡(58.73±3.25)歲；平均病程(2.42±0.28)個月。對照組中，男性15例，女性5例；年齡39～70歲，平均年齡(58.65±3.21)歲。各組研究對象年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血及骨髓單個核細胞提取 抽取研究對象3 ml骨髓及外周血樣本，抗凝使用肝素，1 500 r/min條件下離心10 min，取上清。在含有淋巴細胞分離液的尖底離心管中沿壁將無菌管緩慢加入，保持兩個界面相對清晰，離心后，將離心管取出。將界面層細胞(單個核細胞)使用吸管吸出，使用無菌生理鹽水清洗2遍，離心收集單個核細胞，使用加有10%滅活胎牛血清、谷氨酞胺、即用型鏈霉素/青霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞進行計數(shù)，并將細胞濃度調整為1×107個/ml。

1.2.2 外周血及骨髓單個核細胞Treg細胞、Th17細胞檢測 將2×106的骨髓單個核細胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，每個孔中加入1 ml，再向其中加入2 nmol/ml的莫能菌素、1 ng/ml的離子霉素、20 ng/ml的丙二醇甲醚醋酸酯，置于培養(yǎng)箱中，在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)4 h。細胞收集后，將其分為實驗管和對照管，加入CD4-FITC、CD3-APC抗體，避光孵育30 min。棄上清液，加入4%的多聚甲醛固定，室溫條件下處理20 min，0.1%皂素穿膜10 min，棄上清液，每個管道留置200 μl的穿膜液重懸細胞。加入10 μl的IL-17PE抗體，同行對照中加入相應對照抗體，室溫條件下孵育1 h。洗滌后，上流式細胞儀檢測Th17細胞百分比。將1 ml含有2×106個/ml的骨髓單個核細胞懸液分為實驗管和對照管。洗滌后細胞重懸于200 μl洗液中，加入CD127 Perep-cy5.5、CD25-FITC、CD4-PE，室溫條件下孵育15 min，PBS洗液洗滌，對照管中加入相應對照抗體，4℃條件下孵育15 min，上流式細胞儀檢測Treg細胞。

1.2.3 外周血IL-17、IL-21、IL-1β、轉化生長因子-β水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法對血清IL-17、IL-21、IL-1β、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)水平進行測定，試劑盒購于武漢賽培生物，操作方法按照說明書執(zhí)行。

2 結果

2.1 各組研究對象外周血單個核細胞Treg細胞、Th17細胞比例比較 與對照組比較，AML組和MDS組外周血單個核細胞Treg細胞、Th17細胞比例明顯升高，且MDS組高于AML組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MDS-RA亞組外周血單個核細胞Treg細胞、Th17細胞比例高于MDS-RAEB亞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組研究對象外周血單個核細胞Treg細胞、Th17細胞比例比較

2.2 各組研究對象骨髓單個核細胞Treg細胞、Th17細胞比例比較 與對照組比較，AML組和MDS組骨髓單個核細胞Treg、Th17細胞細胞比例明顯升高，且MDS組高于AML組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MDS-RA亞組骨髓單個核細胞Treg細胞、Th17細胞比例高于MDS-RAEB亞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組研究對象骨髓單個核細胞Treg細胞、Th17細胞比例比較

2.3 AML、MDS患者Th17細胞與Treg細胞相關性分析 Pearson相關性分析顯示，AML、MDS患者Th17細胞與Treg細胞均呈現(xiàn)一定正相關(r=0.467、0.539，P<0.05)。

2.4 各組研究對象外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平變化 與對照組比較，AML組和MDS組外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平明顯升高，且MDS組高于AML組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。MDS-RA亞組外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平明顯高于MDS-RAEB亞組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組研究對象外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平變化

3 討論

人體正常機體活動需要各種免疫細胞(尤其是T淋巴細胞)平衡的維持，這種平衡一旦被打破，免疫功能抑制或者亢進，進而造成機體免疫疾病的發(fā)生[8]。CD4+T細胞亞群包括Th17、Th2、Th1及Treg細胞，其中Th17和Th1細胞具有明顯的增加細胞凋亡和抗腫瘤的作用，而Treg細胞和Th2細胞的主要功能為免疫制劑[9]。Th17細胞可表達CCR6、CCR4、IL-12，孤獨性受體γt也是Th17細胞的重要特異性轉錄因子，與信號轉導和轉錄激活因子3相互協(xié)同，對IL-17的產(chǎn)生和Th17的分化產(chǎn)生刺激作用[10]。Treg細胞是一類具有獨特負性調節(jié)作用的細胞，可表達生成Foxp3、CD3+、CD4+細胞，其中Foxp3對Treg細胞的功能維持及分化具有重要的作用[11]。正常生理條件下，TGF-β對初始的CD4+細胞產(chǎn)生影響，誘導其分化為調節(jié)性T細胞，同時在TGF-β和IL-6的共同刺激下，可分化生成Th17細胞[12]。在激活的神經(jīng)突觸細胞或者IL-6的存在下，Treg細胞可自身分化為Th17細胞，通過免疫調節(jié)網(wǎng)絡對Th17/Treg細胞的動態(tài)平衡產(chǎn)生維持作用[13]。有研究報道，在自身免疫性疾病中，IL-17R與促炎因子IL-17特異性結合，從而對相關信號通路進行激活，對相關炎癥因子及趨化因子的釋放產(chǎn)生促進作用，擴大自身免疫性反應及炎癥反應，使Th17細胞/Treg細胞平衡向Th17細胞偏移[14]，但其在AML及MDS疾病發(fā)展過程中發(fā)揮促進還是抑制作用尚無定論。Owattanapanich等[15]研究報道，與正常人相比，進展期胃癌患者外周血Th17細胞數(shù)量明顯較高，且與臨床病理分期存在一定的相關性。本研究結果顯示，MDS組患者Th17細胞明顯高于對照組及AML組，且隨著病情的進展，其Th17細胞數(shù)量逐漸增加；相關性分析表明，AML、MDS患者Th17細胞與Treg細胞均呈現(xiàn)一定正相關(P<0.05)。Yuan等[16]研究報道，在MDS骨髓環(huán)境中，Th17細胞比例和Treg細胞比例及相應絕對數(shù)均呈現(xiàn)升高趨勢，與本研究結果一致。Dostalova等[17]研究報道，肺癌中Treg細胞與Th17細胞均顯著提高，且兩者呈現(xiàn)一定相關性。Tsutsumi等[18]研究報道，宮頸癌患者中Treg細胞及Th17細胞均一定程度增加，兩種細胞平衡被打破。上述研究證實，在外周血及骨髓微環(huán)境中，Th17細胞與Treg細胞均呈現(xiàn)一定的正相關性。

AML與MDS之間的關系傾向于量變引發(fā)的疾病發(fā)展，而非質變引發(fā)的疾病轉化。Britt等[19]研究報道，晚期MDS患者體內骨髓組織中IL-22、IL-21、IL-17呈現(xiàn)高水平表達，提示體內的Treg細胞逐漸向Th17細胞轉化。而本研究結果顯示，MDS患者血清IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21水平明顯高于對照組及AML組，且隨著MDS病情的發(fā)展，上述指標水平越高。其中，Treg細胞分泌的IL-1β、TGF-β呈現(xiàn)高水平表達，提示患者機體免疫耐受性相對增加。此外，IL-1β、TGF-β、IL-17、IL-21均可以促進Th17細胞的不斷分化及擴增。在卵巢癌、宮頸癌等腫瘤研究中已經(jīng)證實，IL-17可以通過對新生血管形成產(chǎn)生刺激作用，從而誘導這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20]。因此，AML到MDS可能是疾病量化而導致的疾病進展，而MDS骨髓組織中擴增的Th17、Treg細胞通過分泌大量細胞因子一方面對新生血管增生產(chǎn)生促進效果，利于細胞增殖和疾病進展，另一方面對機體免疫系統(tǒng)活性有效抑制，增強機體對腫瘤細胞的免疫耐受性。

綜上所述，AML和MDS患者外周血及骨髓組織Th17細胞、Treg細胞均升高，外周血IL-17、IL-21、IL-1β、TGF-β水平均明顯升高，其可以誘導新生血管增生，抑制機體免疫活性，促進疾病發(fā)生發(fā)展。