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        熊果苷對乙酰膽堿-氯化鈣混合液誘導心房顫動大鼠心臟保護作用及其機制研究

        2022-05-14 08:09:20徐銀麗徐登月于立明趙繼凱王輝山
        臨床軍醫(yī)雜志 2022年4期
        關鍵詞:心房心電圖心臟

        徐銀麗,徐登月,于立明,趙繼凱,黃 濤,王輝山

        北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管外科,遼寧 沈陽 110016

        心房顫動(atrial fibrillation,AF)為臨床上最常見的心律失常之一[1]。近年來,由于人口老齡化、慢性心臟病及其他因素影響,患病率呈上升趨勢,給患者家庭及社會造成沉重的經濟負擔。傳統(tǒng)的治療AF藥物如果使用不當,可導致患者藥物性心律失常。手術治療方式成本高、過程復雜、患者依從性差,并且術后存在復發(fā)風險。有研究表明,組織炎癥與AF的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯系[2-3],AF導致的血栓形成與白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等多種炎癥因子均相關[3]。目前,AF的發(fā)病機制仍不明確。因此,進一步明確AF病理生理機制,尋找更為安全有效的預防及治療手段至關重要。熊果苷(arbutin,AR)具有抗燙傷與抗氧化的特性[4],通過抗氧化作用,能有效預防和保護腦細胞損傷[5]。同時,AR具有鎮(zhèn)咳、祛痰及平喘的藥理學作用,并能通過激活成骨細胞改善骨質疏松,下調大鼠C6膠質瘤細胞炎癥因子,進而誘導大鼠C6膠質瘤細胞凋亡[6-8]。本研究通過建立乙酰膽堿-氯化鈣混合液(acetylcholine chloride,Ach-CaCl2)誘導的大鼠AF模型,旨在探討AR對AF大鼠的心臟保護作用及可能機制。現報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物及試劑 選取30只8周齡健康雄性SD大鼠(購自北京維通利華實驗動物有限公司),體質量225~275 g。適應性喂養(yǎng)1周,均在環(huán)境溫度25℃下飼養(yǎng),每12 h進行光照/黑暗條件交替,自由飲水攝食。待大鼠適應環(huán)境1周后,進行后續(xù)實驗。AR、Ach-CaCl2均購自中國阿拉丁試劑有限公司。酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA) 試劑盒購自中國江蘇酶免實業(yè)有限公司。IL-6、TNF-α、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,p-PI3K)抗體、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(phospho-protein kinase B,p-AKT)抗體、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phospho-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)抗體、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)抗體、絲氨酸/蘇氨酸激酶(protein kinase B,AKT)抗體、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抗體均購自美國Cell Signaling Technology。

        1.2 研究方法

        1.2.1 模型構建及實驗分組 將30只健康雄性SD大鼠隨機分為3組:正常對照組(Sham組)、AF模型組(AF組)與AR治療組(AR+AF組),每組各10只。3組大鼠適應性喂養(yǎng)7 d。AR+AF組大鼠預先100 mg/(kg·d)AR進行灌胃治療7 d。AF組和AR+AF組大鼠每天尾靜脈注射給予Ach-CaCl2混合液1 ml(內含Ach 66 μg/ml,CaCl210 mg/ml),造模7 d[9]。Sham組大每天尾靜脈注射生理鹽水0.1 ml,共7 d。給藥結束后,取材進行后續(xù)實驗。

        1.2.2 心電圖及超聲心動圖檢測各組大鼠心功能 使用2.0%異氟烷與氧氣(2 L/min)混合氣體吸入進行麻醉,1.5%異氟烷與氧氣(2 L/min)混合氣體維持,采用心電圖機對大鼠進行肢體導聯,采集心電圖。待心電圖記錄儀上各導聯平穩(wěn)后,尾靜脈注射Ach-CaCl2混合液,給藥時間控制在30 s。開始給藥后,大鼠陸續(xù)被誘發(fā)了陣發(fā)性AF,待陣發(fā)性AF自行恢復至正常心律后停止記錄。記錄完最后1次心電圖后,剔除大鼠胸腹部毛發(fā),涂上耦合劑,使用大鼠專用探頭,采用小動物彩色超聲進行超聲心動圖檢查。以二維超聲模式截取大鼠心臟的心動圖,測量大鼠的左心房內徑(left atrial diameter,LAD)評估左心房重構情況;以M型超聲測量左心室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter,LVDD)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter,LVDS)評估對大鼠左心室影響情況[10]。

        1.2.3 心房組織Masson染色檢測心肌纖維化程度 取各組大鼠心房肌組織,經4%多聚甲醛固定、梯度脫水、浸蠟包埋、切片貼片、常規(guī)脫蠟后,行Masson染色。觀察各組大鼠心房肌組織膠原纖維的增生情況。

        1.2.4 ELISA檢測各組大鼠血清炎癥因子 收集各組大鼠腹主動脈血1.2 ml,以3 000 r/min離心15 min,分離上層血清。測定大鼠血清TNF-α、IL-6水平。實驗過程嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。每個樣本設置3個復孔,取3個復孔的平均值。

        1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測大鼠心房組織炎癥相關蛋白 取各組大鼠心房組織,分別稱量40 mg,加入200 μl蛋白裂解液,采用超聲破碎的方式提取組織蛋白。采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測心房組織p-PI3K、p-mTOR、p-AKT、TNF-α、IL-6、PI3K、AKT和mTOR等指標蛋白表達情況。

        1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計學軟件對數據進行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 各組大鼠AF持續(xù)時間比較 Sham組大鼠為正常心電圖,竇性心律;AF組大鼠P波消失,代之以不規(guī)則的f波,心室率絕對不齊;AR+AF組大鼠為房撲心電圖。AF組大鼠AF持續(xù)時間顯著多于Sham組、AR+AF組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

        圖1 AR對AF大鼠心臟電生理的影響(a.各組大鼠心電監(jiān)測圖;b.各組大鼠AF持續(xù)時間統(tǒng)計圖)

        2.2 各組大鼠LAD比較 各組大鼠超聲心動圖中,上半部分為二維超聲圖,下半部分為M型超聲圖。AF組大鼠LAD大于Sham組、AR+AF組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

        圖2 AR對大鼠心房重構影響(a.各組大鼠超聲心動圖;b.各組大鼠LAD比較)

        2.3 AR對大鼠組織形態(tài)的影響 各組大鼠心房組織Masson染色結果見圖3。Sham組心房肌組織正常,排列整齊,幾乎觀察不到間隙間膠原纖維;與Sham組相比,AF組心肌纖維紊亂,膠原纖維較多;與AF組相比,AR+AF組心肌排列稍有紊亂,僅存在少量膠原纖維。

        圖3 各組大鼠心房組織 Masson 染色圖(Masson×400)

        2.4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 與Sham組相比,AF組、AR+AF組的IL-6、TNF-α水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與AF組比較,AR+AF組的IL-6、TNF-α水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

        圖4 各組大鼠血清IL-6、TNF-α水平比較(a.IL-6水平;b.TNF-α水平)

        2.5 AR對AF大鼠心房組織炎癥相關蛋白的影響 與Sham組比較,AF組蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、TNF-α、IL-6表達顯著增多,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與AF組比較,AR+AF組蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、TNF-α、IL-6表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot檢測結果見圖5。

        圖5 AR對AF大鼠心房組織炎癥相關蛋白的影響(a.p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達量;b.TNF-a、IL-6蛋白表達量)

        3 討論

        AF為最常見的心律失常。有研究發(fā)現,在心臟組織和循環(huán)中介導炎癥反應的免疫細胞和蛋白質的浸潤與AF有關[3,7-8]。此外,心臟或體循環(huán)中存在的炎癥相關指標,可用于預測普通人群以及心臟電復律和射頻消融術后患者AF的發(fā)病及復發(fā)。炎癥反應介質可改變心房電生理和結構基質,從而導致AF的易感性增加。炎癥因子還可以調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)和連接蛋白,與AF和異質性心房傳導的觸發(fā)相關[9-11]。血栓栓塞是AF的常見并發(fā)癥,其發(fā)生與炎癥活動有關。AR,化學式為C12H16O7,分子量272.25,是一種由杜鵑花科植物熊果葉中萃取出的成分。AR是酪氨酸酶的競爭性抑制劑,能夠通過抑制體內酪氨酸酶的活性,阻止黑色素的生成,從而減少皮膚色素沉積,祛除色斑和雀斑,并且對黑色素細胞毒性很小,是目前常用的褪色藥物[12]。同時,AR還有殺菌、消炎的作用,目前主要應用于化妝品中,同時也是腸道消炎用藥原料[13]。

        本研究結果發(fā)現,AF組大鼠AF持續(xù)時間顯著多于Sham組、AR+AF組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這說明,AR在大鼠陣發(fā)性AF模型中對大鼠心臟起到保護作用。小動物心臟超聲結果提示,AF組大鼠LAD大于Sham組、AR+AF組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這說明,AR能明顯縮短AF大鼠LAD,改善AF大鼠左心房擴大的情況。另有研究表明,與正常竇性心律人群相比,單純性AF患者心房組織會出現膠原纖維的堆積[10]。本研究通過AF大鼠心房組織Masson 染色,可以看到AF組與AR+AF組比較,AF組膠原纖維較多,但心肌纖維化程度較低,可能與本研究造模時間短有關。有研究表明,AR具有可以增強自噬、抑制炎癥和凋亡的作用[12-15]。本研究結果還顯示,與Sham組比較,AF組蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、TNF-α、IL-6表達顯著增多,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與AF組比較,AR+AF組蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、TNF-α、IL-6表達明顯降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這表明,AR對大鼠心臟的保護作用可能與其抑制炎癥作用有關。

        綜上所述,AR可通過抑制PI3K-AKT、mTOR通路減輕炎癥,在大鼠陣發(fā)性AF模型中起到保護作用,具體分子機制仍需進一步深入研究。

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