溫雨欣，巢暉

中山大學化學學院，生物無機與合成化學教育部重點實驗室，廣州 510006

1 引言

一氧化氮分子(NO)曾是一個普通的無機分子，一度被認為是廢氣和空氣污染物，人們很難將它與生物體內(nèi)的健康調(diào)控聯(lián)系起來。然而，1998年三位美國科學家因發(fā)現(xiàn)“NO在心血管系統(tǒng)中起信號分子作用”而共同獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，自此以后，以NO為代表的無機小分子氣體作為氣體信號分子在生物體內(nèi)的作用引起了科學家們的關注并前赴后繼。早些年科學家氣體信號分子的研究主要集中在NO、CO和H2S，如Lippard課題組[1]開發(fā)了一組基于金屬復合物(Co(II)、Fe(II)、Ru(II)、Rh(III)和Cu(II)復合物)開啟熒光的NO傳感器；林偉英課題組[2]基于硝基還原反應開發(fā)了一種新的CO熒光探針用于檢測活細胞溶酶體中的CO，唐波課題組[3]構建了一種基于氰的近紅外比率型熒光探針以進行快速且高靈敏度地檢測內(nèi)源性H2S等，這些研究的發(fā)現(xiàn)又在一定程度上促進了化學家們對活體內(nèi)氣體信號分子的探索。

但是，盡管化學家對上述幾種氣體信號分子有較為全面且深入的研究，卻對內(nèi)源性SO2的研究和示蹤鮮有報道，使得SO2只能以空氣污染物和酸雨的成因長期存在于人們的視野，誤以為其只能外源性產(chǎn)生和攝取而忽略了其在生物體內(nèi)的作用。然而，近年來，隨著生物體內(nèi)檢測技術的提高和檢測范圍的擴大，人們逐漸注意到SO2不僅能在生物體內(nèi)內(nèi)源性生成，而且作為氣體信號分子在生物體中起到調(diào)控作用，調(diào)節(jié)某些mRNA和蛋白質(zhì)的表達并影響生理系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)。本文就SO2在生物體內(nèi)的內(nèi)源性生成、生理作用和熒光檢測三大方面進行闡述，旨在向讀者揭示SO2鮮有人知的一面，即作為信號分子如何在生物體內(nèi)發(fā)揮作用，并綜述了近年來化學家們對內(nèi)源性SO2進行檢測和復雜的代謝循環(huán)示蹤的探索過程。

2 生物體內(nèi)SO2的來源與作用

作為氣體信號傳送器，SO2在生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)作用不容小覷，在維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關重要的作用。與多數(shù)內(nèi)源性活性物質(zhì)相似，內(nèi)源性SO2在不同的生理濃度下發(fā)揮著不同的作用，可分為低濃度的生理調(diào)節(jié)作用和高濃度的毒理作用：在低濃度的時候，SO2可以起到抗氧化、減少炎癥以及抗抑郁和抗焦慮的作用，特別是在血管調(diào)節(jié)方面，SO2與抗高血壓、抗動脈粥樣硬化和抑制血管硬化的調(diào)節(jié)作用密不可分[1]；但在高濃度的時候，SO2會引起某些呼吸道疾病、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂甚至是癌癥[6]。因此，高效檢測生物體內(nèi)的SO2顯得尤為重要。

3 生物體內(nèi)SO2的檢測

3.1 SO2的熒光檢測原理

這些探針在生物體內(nèi)實現(xiàn)對SO2特異性檢測最重要的是要有合適的反應位點，而SO2與反應位點的特異性結合恰恰是基于我們耳熟能詳?shù)囊恍┗A反應，特別是親核加成反應，主要可以分為SO2催化乙酰丙酸酯水解、SO2與醛基的加成反應和Michael加成反應三種(圖1)。

圖1 三種親核加成反應的檢測原理

(1)SO2催化乙酰丙酸酯水解。

化學家常用乙酰丙酸酯來保護官能團，而熒光可以通過保護羥基而淬滅[8]，故利用乙酰丙酸酯可被SO2催化而水解的性質(zhì)可以起到“光開關”的作用，使熒光信號發(fā)生變化，實現(xiàn)對SO2的存在性檢測。華中師范大學馮國強課題組[9]基于乙酰丙酸酯脫保護的機理開發(fā)了一種用于亞硫酸鹽陰離子的近紅外(NIR)熒光探針(probe 1)，該探針使用萘的硫化物作為NIR熒光素和兩個乙酰丙酸基團的反應點，并對二甲基亞砜-磷酸(DMSO-PBS)緩沖液中亞硫酸鹽陰離子開啟熒光信號變化以及做出快速且高選擇性的反應。

(2)SO2與醛基的加成反應。

山西大學張永斌課題組[10]基于在弱酸性條件下亞硫酸氫鹽與醛基的特定親核加成反應可以形成氫鍵設計了一種能在生物體內(nèi)快速有效識別SO2的熒光探針(NA-CHO)。由于氫鍵的存在，醛連接的肼與SO2結合形成一個五元環(huán)，而其他硫醇因空間位阻而不能形成五元環(huán)，故該探針可以在生物體內(nèi)特異性檢測SO2而不受其他硫活性物質(zhì)的干擾。

(3)Michael加成反應。

山西大學陰彩霞課題組[11]通過Michael加成反應成功構建了雙位點功能化NIR熒光探針(NIRSP)，該探針能夠用于檢測生物體內(nèi)SO2濃度的高低，表現(xiàn)出具有紅色熒光響應的低濃度SO2和具有藍色熒光增強功能的高濃度SO2，具體來說，該探針能夠辨別SO2濃度的高低是基于NIR-SP中不飽和C＝C雙鍵(位點1)反應性優(yōu)于醛基(位點2)而實現(xiàn)的，由此我們可以通過SO2結合不同反應位點所產(chǎn)生的熒光信號的不同來判別其濃度的高低。

3.2 外源性SO2的熒光檢測

圖2 熒光探針1的檢測原理[13]

3.3 內(nèi)源性SO2的熒光檢測

圖3 熒光探針SP-2與的反應原理[14]

圖4 在不同掃描深度(80–160 μm)大鼠腦部海馬體切片內(nèi)亞硫酸鹽的熒光成像[16]

這些實驗及其結果在一定程度上為SO2作為生物體內(nèi)信號分子的觀點提供了實驗支撐，同時也為檢測內(nèi)源性SO2并進行代謝示蹤奠定了良好的實驗基礎。

3.4 SO2熒光探針的分類

當前，隨著時代的發(fā)展，各種材料的結合逐漸凸顯出其性能上與眾不同的優(yōu)越性，檢測SO2的熒光探針的發(fā)展也不僅僅局限于單一的結構和材料，故按材料我們大致可以將其分為金屬配合物熒光探針、有機小分子熒光探針和納米材料熒光探針三類。

(1)金屬配合物熒光探針。

圖5 金屬配合物熒光探針I(yè)r4[20]

(2)有機小分子熒光探針。

有機小分子熒光探針是最常見的檢測生物體內(nèi)氣體信號分子的一種探針，通過熒光基團和能與目標分子發(fā)生特異性反應的有機小分子基團雜交，調(diào)節(jié)其在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性從而具有生物成像能力。中南大學宋相智課題組[19]將帶正電的苯并吡喃和香豆素結合，開發(fā)了一種具有優(yōu)異水溶性和高選擇性的近紅外熒光探針(Probe 2)(圖6)，該熒光探針可在生物系統(tǒng)中定量和特異性檢測SO2。

圖6 有機小分子熒光探針Probe 2

(3)納米材料熒光探針。

石墨烯量子點(GQDs)是一種性能優(yōu)越的納米碳材料，例如高量子產(chǎn)量、良好的水溶性和生物相容性[21]，且因為GQDs和有機分子探針之間的π-π相互作用，它們之間可能會存在FRET效應[22]，這些均為應用于生物成像提供了可能性?；谶@一點，濟南大學林偉英課題組[23]開發(fā)了一種獨特的多比例復合熒光探針(CP@GQDs-OH)(圖7)，該新型納米材料熒光探針對SO2具有三種線性比例變化的高選擇性，成功應用于檢測活細胞和斑馬魚中的SO2，為多比例熒光探針的開發(fā)開辟了新的道路。

圖7 多比例復合熒光探針CP@GQDs-OH

4 生物體內(nèi)SO2代謝的熒光示蹤

新陳代謝是一個生物體健康運作所必需的生命過程，監(jiān)測生物體內(nèi)各物質(zhì)代謝的復雜過程已成為化學家和生物學家所關注和面臨的重要問題。隨著對SO2的親核加成反應的不斷深入以及聯(lián)合各種協(xié)同機制，化學家們不愿僅僅停留在檢測生物體內(nèi)源性SO2的有無以及含量上，更多的是開始考量SO2在復雜體系所充當?shù)慕巧约八伎既绾螌O2在體內(nèi)的代謝進行示蹤，以期許更全方位地了解SO2與生物健康的關系。

山西大學陰彩霞課題組[24]通過ICT-FRET協(xié)同機制合理設計并利用了一種新的多信號熒光探針(Mito-CM-BP)同時檢測谷胱甘肽(GSH)及其代謝物SO2，該探針實現(xiàn)了在兩個獨立通道中可視化從GSH到SO2的新陳代謝過程并且無光譜交叉干擾(圖8)。具體來說，基于通過哺乳動物體內(nèi)的硫磺轉(zhuǎn)移酶(硫轉(zhuǎn)移酶)，Na2S2O3可以結合GSH從而產(chǎn)生內(nèi)源性二氧化硫衍生物[25]，亞硫酸鹽氧化酶(SUOX)的存在可以將亞硫酸鹽氧化成硫酸鹽[26]的背景，通過與探針預處理的細胞與Na2S2O3孵化一段時間后GSH的消耗過程來評估Mito-CM-BP監(jiān)測GSH代謝的能力；然后以RNA干擾降低了細胞中的SUOX水平為理論基礎，通過敲除siRNA-SUOX后細胞表現(xiàn)的熒光變化來說明siRNA對SUOX活性的抑制將會導致細胞內(nèi)SO2水平的增加，從而表明了該探針能用于實時示蹤活細胞中SO2的新陳代謝過程；最后通過在腫瘤模型中檢測SO2代謝過程的能力，進一步說明了該探針可以作為可視化生物體內(nèi)SO2代謝過程的有力工具。

圖8 Mito-CM-BP的設計和檢測原理[24]

更重要的是，該探針已成功應用于活細胞和小鼠模型中，對其進行SO2的實時監(jiān)測，闡明了GSH與TST(硫代硫酸轉(zhuǎn)移酶)之間的酶反應可以代謝SO2和實現(xiàn)了對SO2在SUOX下可以轉(zhuǎn)化為硫酸鹽過程的可視化，推動了SO2產(chǎn)生的途徑的闡明并有助于發(fā)現(xiàn)SO2及其衍生物在生命系統(tǒng)中的新作用。

5 結語

通過上述研究結果展示，熒光檢測可以幫助我們在生物體內(nèi)對內(nèi)源性SO2進行存在性檢測和代謝示蹤，更深入地了解SO2與GSH等活性物質(zhì)在生物系統(tǒng)中相互關聯(lián)的生理功能，為洞悉SO2等氣體信號分子與生命健康之間的內(nèi)在聯(lián)系提供有力的技術支撐。